巯基修饰寡核苷酸 DDT 还原协议

還原二硫鍵

本方案將硫醇修飾的寡核苷酸的二硫鍵還原為活性巯基形式（圖 1）。巯基可用于将寡核苷酸附着到固体表面，如金纳米粒子。使用二硫蘇糖醇 (DTT)（也稱為 Cleland's reagent）還原二硫鍵，也可以防止引物二聚體。

圖 1. 5'-Thiol-Modifier C6 S-S 寡核苷酸的二硫鍵還原示例。硫醇修飾的寡核苷酸是以二硫化物的形式出貨，以防止自發的、不受控制的氧化，氧化反過來會導致二聚物的形成，從而使寡核苷酸失去作用。

耗材

2 mL 離心管 吸頭 Mil/TW/zhli-Q^® H₂O DTT (D9779) NAP?-10色譜柱 (GE17-0854-01) 磷酸鈉緩衝液 硫醇修飾寡核苷酸

Method

本方法分為兩個主要步驟：

巯基形成

1. 在 pH 8.3 - 8.5 的 100 mM 磷酸钠缓冲液中制备 100 mM 的 DTT 溶液。
2. 為了達到 12.5 OD（光密度單位；為了>12.5 OD，保持 DTT 溶液與寡核苷酸 OD 的比例為 10:1），將硫醇修飾的寡核苷酸溶解在 125 µL 的 DTT 溶液中。
3. 室溫孵育 1 小時。

副產物去除

1. 用約 15 mL 100 mM 磷酸鈉緩衝液（pH 6.0）平衡 NAP-10 試劑柱。
2. 向 NAP-10 柱中加入 1.0 mL 反应混合物（根据需要使用 pH 6.0 磷酸钠缓冲液使反应混合物体积达到 1.0 mL）。讓反應混合物完全進入凝膠床。
3. 將硫醇修飾的寡核苷酸用 1.0 mL 磷 酸鈉緩衝液（pH 6.0）離心管稀釋。

其他注意事項

依照標準實驗室作法製備 pH 8.3 - 8.5 和 6.0 的磷酸鈉緩衝液。使用 Milli-Q^® 水製作所有緩衝液。