含有 Cys 的肽可以還原（巯基）或氧化的鏈間/鏈內二硫鍵形式存在。因此，合成含有 Cys 的多肽對多肽化學家而言是一項特殊的挑戰。若要以良好的收率獲得具有正確結構的多肽，必須仔細規劃合成策略。選擇最合適的巯基保護基團是非常重要的，因為一個 「錯誤 」的選擇可能會在合成或後續二硫鍵形成過程中導致難以克服的困難。
重要的是要記住，這裡描述的程序只是一個起點，不能保證在任何情況下都有效。問題取決於順序，通常需要對反應條件進行相當程度的優化。如果發生困難，我們的技術服務人員很樂意為您提供協助。有關含半胱氨酸多肽的管理討論，以及詳細的實用方案，請參閱參考文獻。
胱氨酰保護
有多種胱氨酰保護基團可用於 Fmoc SPPS（固相多肽合成）。選擇取決於所需肽的性質和合成策略。Fmoc SPPS 中常用的硫醇保護基團總結（表 1）。
對於含有游離硫醇基團的胱氨酰肽的常規合成，特別推薦使用三苯甲基基團，因為它對 TFA（三氟乙酸）無效，因此在常規裂解程序中會被去除。
對於硫醇基團的樹脂選擇性修飾或樹脂上二硫化物的形成，STmp 和 Mmt 是最有用的，因為它們可以在與 Fmoc SPPS 中使用的標準側鏈保護基團正交的條件下去除。
選擇性二硫化保護基團的過程並不那麼簡單，要找到最佳組合可能需要大量的實驗。有關這個問題的詳細討論如下： 受保護半胱氨酰肽氧化形成二硫鍵。
| 裂解試劑 | Acetamidomethyl(Acm)< | Hg2+, Ag+, I2, Tl, RSCl, PhSOPh-CH3SiCl3 | 對 TFA 穩定。可在易氧化的硫醇基團釋放前，以受保護的形式純化多肽。使用 I2 或 Tl3 處理可去除 Acm 並同時形成二硫鍵 |
|---|---|---|---|
| t-Butyl(tBu) | Hg(II)、HF(20oC)、TFA/DMSO、PhSOPh-CHSiCl3SiCl3 | 對 TFA 和碘氧化穩定。用 MeSiCl3/PhSOPh 處理可去除 t-Bu，並在一個步驟中完成環化，而不會擾亂現有的二硫鍵。在酸中使用 DPDS 處理，會在現有二硫橋和 Cys(Acm) 的存在下直接形成 Cys(Pys)。 | |
| Trityl(Trt) | Hg2+, Ag+, I2, Tl3+2, Tl3+ | 在 Fmoc SPPS 中常規使用的有用衍生物，因為它可以直接從 TFA 裂解反應中產生巯基肽。 | |
| Diphenylmethyl(Dpm) | Hg2+、Ag+、I2、Tl3+, TFA, I2, Tl3+ | 常用於 Fmoc SPPS 的有用衍生物，因為它可以直接從 TFA 裂解反應中產生巯基肽。可與 Mmt 組合使用，因為在使用 2% TFA 移除 Mmt 時，Dpm 不會出血。 | |
| Tetrahydropyranyl(Thp) | Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, TFA, I2, Tl3+ | 在 Fmoc SPPS 中常規使用的有用衍生物，因為它直接從 TFA 裂解反應中產生巯基肽。可替代 Trt 組。與 Trt 相比，其使用可減少消旋化和 b-消除。 | |
| t-butylthio(StBu) | RSH, R3P | 在不使用硫醇清除劑的情況下，對 TFA 穩定。已與 Acm 結合使用，以選擇性地形成兩個二硫鍵。然而，移除速度較慢，因此 STmp 是進行樹脂上脫保護的首選。 | |
| RSH, R3P | 如果不使用硫醇清除劑，對 TFA 中等穩定。已與 Mmt 結合使用，以選擇性地在樹脂上形成兩個二硫鍵。 | ||
| 4-Methoxytrityl(Mmt) | 2% TFA in DCM、Hg2+、Ag+, I2, Tl3+, | 可以選擇性地移除肽，而肽仍然附著在固相上。是在樹脂上形成二硫鍵或修飾 Cys 側鏈的理想選擇。 | |
| 3-Nitro-2-pyridinesulfenyl(Npys) | RSH, R3P | 在不使用硫醇清除劑的情況下，對 TFA 穩定。活化硫醇基團以形成二硫鍵。適用於選擇性製備混合二硫化物。 |
使用受保護半胱氨酸衍生物的 Fmoc SPPS
與其他 Fmoc 保護的氨基酸相反，Fmoc 保護的 Cys 衍生物在標準偶合反應中會發生顯著的消旋化。當使用 HBTU/DIPEA 等鹼介導的方法進行羧基活化時，問題尤其嚴重。微波加熱和預活化會使問題更加嚴重。幸運的是，如果使用預先形成的對稱酐2 或 OPfp 酯3 或使用 DIPCDI/HOBt 或 DIPCDI/Oxyma 活化，在酸性/中性條件下進行偶合，消旋化可以忽略不计。
The synthesis of a peptide acid containing a C-terminal cysteine residue require special consideration as extensive epimerization4 和β-哌啶基丙氨酸的形成5 可能會在延鏈過程中發生。這些副反應在半胱氨酸殘基錨定在 Wang 型樹脂上時最容易發生問題。所幸的是，使用三苯甲基樹脂6 如 2-氯三苯甲基樹脂、NovaSyn TGT、NovaPEG 三苯甲基樹脂似乎可以將這些問題降低到可接受的水平，因此強烈推薦用於合成含有 C末端半胱氨酸的肽酸。
胱氨酸肽的合成
Cys(Trt)、Cys(Thp)和Cys(Dpm)
合成含有游離巯基的肽時，使用Fmoc-Cys(Trt)-OH是最具成本效益的方法。
由於三苯甲基陽離子的高穩定性和硫醇基團的強親核性，此反應是可逆的，因此需要特別注意裂解條件，以確保完全脫保。Cys(Trt)殘基的不完全脫保問題通常可透過使用含有 TIS7a 的裂解混合試劑來解決。此種試劑能非常有效地淬滅三苯甲基陽離子，使其不可逆地轉換成三苯基甲烷。
對於含有多個 Cys(Trt) 殘基的多肽，如果直接從 TFA 裂解混合物中將多肽沉澱到二乙醚中，可以獲得最佳結果。在裂解混合液中加入 2.5 % 乙二硫醇有助於確保勝肽維持在還原狀態，並將半胱氨酸硫醇基烷基化所產生的副產品降至最低。必須使用足夠的裂解雞尾酒，以應付所裂解的多肽量。一般每 0.5 mmole 使用 30 mL 即可。(但是，如果肽含有多個 Cys 殘基和多個 t-butyl 保護基團，則需要增加 EDT 的濃度或雞尾酒的用量，以確保有效的清除。
最近，Fmoc-Cys(Thp)-OH 被引入作為 Fmoc-Cys(Trt)-OH 的替代品，其中的巯基被可酸解的四氫吡喃基 (Thp) 基團保護7b。使用 Fmoc-Cys(Thp)-OH，結果顯示比相應的 S-Trt、S-Dpm、S-Acm 和 S-StBu 衍生物更優異。在長時間的哌啶處理過程中，附著在 Wang 樹脂上的 C 端半胱氨酸殘基可觀察到明顯較低的消旋化及 -哌啶基丙氨酸形成。與 Fmoc-Cys(Trt)-OH (3.3%) 和 Fmoc-Cys(Dpm)-OH (6.8%) 相比，Fmoc-Cys(Thp)-OH 在 DIPCDI/Oxyma 純偶合過程中的消旋化率僅為 0.74%。使用 TFA/water/TIS 95:2.5:2.5 處理兩小時後，即可完全去除 Thp 組。然而，Thp 基團對 DCM 中的 1% TFA 是穩定的，這有助於在超酸性樹脂 (例如 2-chlorotrityl 或 HMPB 樹脂) 上合成受保護的縮氨酸片段。
Fmoc-Cys(Dpm)-OH是Fmoc SPPS7c過程中引入Cys殘基時Fmoc-Cys(Trt)-OH的重要替代品。使用 Dpm 和 Mmt 巯基保護基團的組合，可輕鬆實現含兩個二硫化橋的環肽的區分選擇性合成。S-Dpm 保護對 1 - 3% 的 TFA 是穩定的，相反地，S-Trt 會被緩慢地裂解，但會被 95% 的 TFA 所去除。這些特性使得 S-Mmt 基團可以在固相上使用稀釋的 TFA 移除，而不會失去 S-Dpm 基團。然後，游離的巯基可以被氧化，形成第一個二硫橋。其後再用 TFA/DMSO/anisole cocktail 處理，就能一步將肽從樹脂上裂解、移除 S-Dpm 基團，並形成第二個二硫橋。
Cys(Acm)和 Cys(tBu)
Acm 和 tBu 保護也可用於製備半胱氨酸肽。然而，這種方法已不再普遍使用。
Acm和 t-丁基對去除所有其他側鏈保護基團所需的條件是穩定的。因此，在裂解這些半胱氨酸保護基團之前，可以對多肽進行中間純化。這些保護基團可藉由醋酸汞 (II) 或三氟甲磺酸銀處理而去除。在後者的情況下，用 HCl-DMSO 的水溶液處理半胱氨酸肽的銀鹽，可直接形成二硫鍵8。
注意：汞和銀鹽具有毒性和腐蝕性；使用這些試劑時必須非常小心。
方法 1：用 Hg(II)9
為了方便起見，這些反應可以在離心管中進行。
- 將 (Acm) 多肽溶於 10% aq.AcOH (5-10 mg/mL)中溶解(Acm)多肽，用冰醋酸非常小心地將溶液的 pH 調至 4.0。
- 加入醋酸汞 (II) (10 eq./Acm) 並用 AcOH 或 aq. NH3 將 pH 重新調至 4.0。
- 加入 β-巯基乙醇（20 eq./Acm），靜置 5 小時。
- 離心除去沉澱物，用 HPLC 對上清液進行脫鹽。
方法 2：用 Hg(II)10
- 將 (tBu) 多肽溶於冰冷的 TFA (5-10 mg/mL)。
- 在所得溶液中加入乙酸汞 (II) (10eq./tBu)，並在一層 N2 下於室溫輕輕攪拌混合物 3 小時。
- 在室溫下減壓蒸發除去 TFA，並將殘餘物重新溶解於 10% 乙酸水溶液中。
- 加入 β-巯基乙醇（20 eq./tBu），靜置 5 小時。
- 離心除去沉澱物，上清液用 HPLC 除鹽。
方法 3：用 Ag(I)11
- 將 (Acm) 多肽溶於 TFA/anisole (99:1)(1 mg/mL)。
- 在所得溶液中加入三氟甲磺酸銀（100 eq./Acm），然後在 4 °C 下攪拌 2 小時。
- 用乙醚沉澱肽銀鹽，並離心分離。
- 在 25 °C 下用 1 M 乙酸中的二硫蘇糖醇 (DTT)（40 eq./Acm）處理肽 3 小時。
- 用 1M HCl/DMSO (1:1) 在室溫下處理多肽過夜。過濾除去 AgCl，以 HPLC 分離出產品。
Cys(t-butylthio)和 Cys(STmp)
將 Cys(tButhio)12 或 Cys(STmp)13 residues into a sequence 允許選擇性地在固相上解除硫醇基的保護，使 Cys residues 改性或在樹脂上形成二硫橋。
只要在裂解反應中不使用硫醇作為清除劑，t-丁硫基對 TFA 是穩定的。它可以用硫醇12 或三烷基膦14,15還原來去除。最近，Góngora-Benítez, et al.16 展示了 20% β-巯基乙醇、0.1 M NMM in DMF 可有效去除固相上的 tbutylthio，其中單獨使用 β- 巯基乙醇或磷化物均不成功。
然而，在實際應用中，要去除固體支持物上的 tButhio 基團往往被證明是非常困難的。因此，Albericio 最近引入了 STmp 基團13。STmp 基團似乎非常容易以溫和的硫代溶解法去除，Albericio 曾報告在固相上去除四個 STmp 基團只需三次 5 分鐘處理 0.1 M N-methylmorpholine (NMM) in DMF containing 5% mercaptoethanol.
方法 4：在樹脂上用硫醇去除 STmp
- 用 5% β-巯基乙醇、O.1
- 用 DMF 清洗树脂，再重复硫醇处理两次。
Cys(Mmt)
在 DCM 中用 2% TFA 对 Cys(Mmt) 残基进行树脂内脱保护，可以批量或连续流方式进行。在後者的情況下，可透過分光光度計在 460 nm 處追蹤三氫陽離子的釋放來監測反應。對於批次合成，可在反應中加入 TIS 或 TES 等三苯甲基清除劑，以提高裂解效果。
理想情況下，反應應在密封的燒結玻璃漏斗中進行，以防止高揮發性的 DCM 揮發，而且過濾反應應在 N2 壓力下進行，而不是使用真空。
方法 5：用 2% TFA 在 DCM 中去除 Mmt。
分批法：
- 在燒結玻璃漏斗（帶水龍頭和塞子的類型）中用 DCM 預先攪拌乾樹脂（1 g）。
- 加入 94:1:5 DCM/TFA/TIS (10 mL)，密封漏斗並搖晃 2 分鐘。
- 重複步驟 2 五次。
- 用 DCM 洗淨樹脂，真空乾燥。
流送法：
- 用 DCM 預浸樹脂 (1 g) 並將其填入反應柱中。
- 泵送 1% TFA 在 DCM 中 (2 mL/min) 通過樹脂。使用 0.1 mm 流通池在 460 nma 下測量柱洗出液的吸光度，即可跟蹤反應。
- 一旦反應結束，即吸光度回復基線，用 DCM 沖洗柱。
a如果肽含有其他三苯甲基保護基團，由於 Trt 基團的浸出速度較慢，吸光度將不會回到基線。
在實踐中，完全去除 Mmt 基團可能難以實現，特別是當 Mmt 位於肽的 C端。延長 2% TFA 處理可能會導致氨基酸側鏈失去保護基團。
處理巯基肽
巯基肽很容易被大气中的氧气氧化，因此在裂解后应立即冷冻干燥，并在氩气下干燥保存。為了減少過早氧化，含半胱氨酸的多肽應在酸性（0.1% TFA）脫氣緩衝液中處理。分析時，HPLC 緩衝液也應使用 He sparging 進行脫氣。含有多個 Cys 殘基的多肽可能需要在裂解後還原。
胱氨酰肽氧化形成二硫鍵
巯基肽的隨機氧化
形成一個或多個二硫橋的最簡單方法是游離巯基肽的隨機氧化。
熱動力控制
在這些技術中，最容易執行的程序是空氣氧化，它可以產生熱釋放最穩定的產品。此程序只需將縮氨酸水溶液暴露於揮發性緩衝液中的大氣中，然後透過凍結分離縮氨酸。在 TFA 裂解 Cys(Trt) 之後立即進行空氣氧化，而不需純化中間的巯基肽，即可輕易製備小型單環肽 (方法 6)。此程序的缺點是反應有時會非常緩慢。活性炭也被證實可以有效催化這個過程17.
方法 6：空氣氧化
- 將半胱氨酰肽溶於 0.1 M 除氣碳酸氫銨 (0.1-10 mg/mL)。
- 讓混合物露天放置，直到反應完成。(The reaction can either be monitored by HPLC or by the Ellman test).
- Iolate the product by lyophilization.
Note: The linear peptide concentration may require optimization to minimize polymer formation.注意：線性肽的濃度可能需要最佳化，以減少聚合物的形成。
方法 7：谷胱甘肽氧化
- 將半胱氨酰肽溶於 0.2 M 除氧磷酸盐缓冲液，pH 7.5（0.1 - 10 mg/mL），其中含有 1 mM EDTA、还原型（5 mM）和氧化型（0.5 mM）谷胱甘肽。
- 將混合物攪拌 1 至 2 天，同時以 HPLC 監測反應。
- 以凍乾方式分離產物，並以 HPLC 或 GPC 進行脫盐。
以半胱氨酸和胱氨酸或還原型和氧化型穀胱甘肽的混合物進行氧化，有助於氧化含有多個二硫橋的肽。過量還原成分的存在會導致中間橋肽緩慢地重新排列為熱穩定的異構體。
動力氧化
各種氧化劑已被用於快速形成二硫橋，以產生動力上最有利的產品。這些氧化劑包括鐵氰化钾18、碘19、DMSO20, 21、N-氯丁二酰亚胺 (NCS) 22 和 DPDS (2,2'-dithiopyridine)23 。
使用碘進行氧化非常快速，只要將碘溶液滴入快速攪拌的多肽溶液中，直到溶液呈現黃色即可。
DMF中的NCS已被用於固相巯基的氧化，只要2個等價物就能在15分鐘內影響氧化22。此試劑可引起蛋氨酸的氧化。
方法 8：游離巯基肽的碘氧化
- 將半胱氨酰肽（0.1 -10 mg/mL）溶解在脫氣的 AcOH/water 或 MeOH/water 中。
- 在快速攪拌下，滴加 0.06 M 碘在 MeOH 中的溶液，直到溶液呈微黃色。用 1M 抗壞血酸淬滅過量的碘。
- 用凍乾法分離出產品，並用 HPLC 或 GPC 進行脫盐。
方法 9：DMSO 氧化
- 將半胱氨基肽溶於 AcOH 中。
- 加入碳酸銨至 pH 6，然後加入 DMSO（10% 體積）。
- 攪拌混合物 4- 24 小時，同時使用 HPLC 監測反應。
- 使用 HPLC 分離產物。
方法 10：DPDS 氧化23
- 將半胱氨酰肽（0.1 - 10 mg/mL）溶於 0.1 M 碳酸氢铵中。
- 加入 5 mM 的 DPDS 在 MeOH 中的溶液（3 等量）。
- 搅拌混合物 30 - 120 分钟，同时用 HPLC 监测反应。
- 用反式脂肪酸酸化并用 HPLC 分离产物。
方法 11：NCS 在樹脂上氧化22
- 去除固相上的 Cys-STmp 或 Mtt 基團。用 DMF 清洗樹脂。
- 在 DMF 中用 NCS（2 eq.）處理縮氨酸樹脂，恆溫 15 分鐘。從樹脂上裂解多肽。不應使用硫醇清除劑，因為這些試劑會導致二硫鍵還原。在大多數情況下，可用 TIS 取代 EDT。
受保護胱氨酰肽氧化形成二硫鍵
碘氧化形成二硫鍵
用碘處理含有 Cys(Acm)/Cys(Trt) 殘基的縮氨酸，會同時去除巯基保護基團和形成二硫鍵。含有單一 Cys 殘基的縮氨酸會轉換為對稱的二聚體，而含有多個殘基的縮氨酸則會轉換為環狀單體和聚合物的混合物，視溶劑和濃度而定。反應速率非常依賴溶劑，因此 Cys(Trt) 和 Cys(Acm) 之間有一定程度的選擇性；在雙極溶劑中，例如 aq.MeOH 和 aq.AcOH 中，Cys(Trt) 和 Cys(Acm) 都會快速反應，而在非極性溶劑中，例如 DCM 和 CHCl3，Cys(Acm) 的氧化作用會非常緩慢24。
此方法最常見的應用是將含兩個 Cys(Acm) 殘基的側鏈脫保護肽轉換成環狀二硫化橋接單體；使用三苯甲基保護並不適合，因為此基團會在 TFA 裂解過程中被移除。該反應通常在高稀釋的 aq.MeOH 或 aq.AcOH 的混合物中高稀釋進行，溶劑的確切選擇取決於順序。反應在 aq.MeOH 中反應最快；但對於含有 Tyr、His 和 Trp 的縮氨酸，aq.AcOH 是首選，因為使用它可以限制這些敏感殘基的碘化。
對於溶液中受保護的肽片段的碘氧化，建議在二硫橋中連接在一起的兩個 Cys 殘基中，一個用 Acm 保護，另一個用 Trt 保護。這項措施可限制聚合物的形成，並允許使用非極性的溶劑混合物，例如 TFE/CHCl3 這些溶劑混合物有利於受保護片段的溶解。含有自由 N-氨基功能的 Cys 殘基的縮氨酸的碘氧化非常緩慢，這可能是氨基上的正電荷抑制了锍中間體的形成。
有報告指出，在碘和铊 (III) 氧化反應期間，Acm 會從半胱氨酸遷移到 Gln25a and Ser/Thr25b residue 的側鏈
方法 12：碘氧化的一般方法
- 將 Cys-Acm 肽（15 µmol）溶於 AcOH（30 mL）中。在 N2 下空白。
- 加入 160 mM aq. HCl (5 mL)。在 AcOH (45 mL) 中加入 20 mM I2 。
- 劇烈攪拌 30-120 分鐘後 (起始物消失後)，滴加 1 M aq. 硫代硫酸鈉或抗壞血酸以淬滅碘，直到混合物呈無色，然後在減壓下蒸發濃縮至原來體積的約三分之一。
另一種方法26：
3. 在劇烈攪拌 30 -120 分鐘後，加入 480 mL 冷二乙醚。在乾冰上冷卻 10 分鐘。
過量的碘也可以通過用 CCl4 萃取溶液，或用活性炭或 Zn 粉末處理來去除。
一鍋形成兩個二硫化物（基於 [27]）
- 在一層 N2 下，將 2xCys, 2xCys-Acm 多肽溶解在 AcOH (2 mg/mL) 中。
- 在 MeOH 中滴加約 1 等量的 I2 （如 0.5 M I2 ），直到出現持續的棕色。再加入 9 等量的碘。加入水、所用 AcOH 體積的 20% 並攪拌混合物
- 如上所述除去多餘的碘
三氟乙酸铊氧化
與碘一樣，Tl(sub>2 也會氧化。與碘一樣，Tl(CF3CO2)3 會將含有多個 Cys(Acm) 殘基的縮氨酸轉換成相應的二硫橋胱氨酸縮氨酸 [28]。在溶液中，此反應通常在 TFA 中進行，因為 TFA 對於游離肽和受保護肽都是極佳的溶劑。若要在固相上直接形成二硫鍵，則採用 DMF 作為溶劑，可使樹脂膨脹良好而不會過早裂解肽鏈。值得注意的是，在 Tl(CF3CO2)3 處理過程中，Met 和 Trp 必須受到保護，以避免這些敏感殘基被氧化；Met(O)和Trp(Mts)以及Trp(Boc)分別與 t-Boc28 和Fmoc29,30 策略結合使用。
注意事項： 铊鹽具有高毒性和腐蝕性；使用這些試劑時必須非常小心。請遵守當地、州/省和聯邦的安全規定。
方法 13：使用 Tl(III)28
- 將多肽溶解於 TFA（1-10 mg/mL）與苯甲醚（10 µL/mg），並在冰浴中冷卻
- 加入Tl(CF3CO2)3 (1.2 eq.)，反應 5-18 小時。
- 在真空中蒸發去除 TFA，用乙醚沉澱多肽。離心並倒出乙醚，除去多餘的铊試劑。
- 加入新的乙醚，振動試管以分散多肽並離心。傾倒乙醚，重複清洗過程三次。
方法 14：用 Tl(III) 29、30
- 將多肽樹脂懸浮於 DMF/anisole (19：1）中，加入 Tl(CF3CO2)3 (1.2 eq. 相对于多肽）
- 在 0 °C 下放置 80 分钟，然后用 DMF 清洗树脂
- 用 TFA 从树脂中去除多肽。不應使用硫醇清除劑，因為這些試劑會導致二硫鍵還原。在大多數情況下，可以用 TIS 取代 EDT。
區域選擇性二硫鍵形成
通過選擇性架橋形成合成多個含二硫鍵的肽不是一項輕易就能完成的任務。在合成含有多個二硫鍵的多肽時，由於所需的生物活性異構體通常在熱力學上是最穩定的，因此透過隨機氧化通常可以獲得最好的結果。適用於一種多肽的方法不一定適用於另一種多肽。有時可以順利形成兩座橋，但第三座橋的形成卻很困難。此外，形成橋的順序通常也很重要。選擇性地形成第一個橋樑可以為其他橋樑的正確形成提供隨機氧化的範本。
為了選擇性地形成兩個二硫鍵，可以使用 Trt 和 Acm 或 STmp 和 Acm 保護的組合：在選擇性地移除 Trt 或 STmp 保護後形成第一個二硫鍵；然後用碘或三氟乙酸铊處理 Acm 保護的縮氨酸，以單一步驟生成第二個二硫鍵。或者，使用 Trt 和 Acm，可以在溶液中進行一鍋反應，其中第一個二硫化物是由二硫化氫肽與等量的碘快速氧化形成的，然後再加入過量的碘和水，以實現 Acm 保護的硫醇的氧化（方法 12）。
STmp和Mmt的結合有助於在固相上選擇性地形成兩個橋樑22。STmp 基團可藉由巯基乙醇處理去除 (方法 4)，而第一個橋樑則可藉由 NCS 氧化形成 (方法 11)。用 2% TFA 在 DCM 中去除 Mmt（方法 5），然後再用 NCS 氧化形成第二個橋。
| First | 評論 | ||
|---|---|---|---|
| Trt | Acm | 1：通過空氣氧化或 Stoichiometric I2 氧化架橋。2：透過過量 I2 氧化。 | |
| tBu | MeBzl | 用DMSO/TFA進行溫控氧化 | |
| STmp | Mmt | 在樹脂上形成的兩種橋與 NCS 氧化 | |
| Mmt | Dpm | 一橋在樹脂中形成。在溶液中透過空氣氧化形成第二個橋樑 | |
| STmp | Acm | 1：在樹脂上與 NCS 氧化。2: 與固相或溶相 I2 氧化。 | |
| STmp | Mmt | Acm | 1 & 2：在樹脂上形成的兩種橋與 NCS 氧化。3: I2 在溶液中氧化。 |
| STmp | Mmt | tBu | 1 & 2：在樹脂上形成兩種 NCS 氧化橋。3:溶液中的 DMSO/TFA 或 MeSiCl3/Ph2SO |
| Trt | tBu | 1：通過空氣氧化或 Stoichiometric I2 氧化架橋。2：透過過量 I2 氧化。3：TFA/DMSO 或 MeSiCl3/Ph2SO。 | |
| Trt | tBu | MeBzl | 1：通過空氣氧化或 Stoichiometric I2 氧化架橋。2 & 3: 以 TFA/DMSO 進行溫控氧化 |
t-Butyl protection, in conjunction with one-step cleavage and cyclization with MeSiCl3/Ph2SO，以引入第三個二硫橋，從而選擇性地合成 -conotoxin 和 insulin31。以類似的方式，在 -conotoxin SI32 的兩個二硫鍵的一鍋選擇性形成中，使用了 tBu 和 MeBzl 半胱氨酸保護的組合。第一個二硫鍵是在室溫下藉由裂解 tBu 基團並同時以 TFA/DMSO/anisole 氧化形成的。隨後加熱至 70 °C，MeBzl 基團裂解，形成第二個二硫橋。有關應用此方法合成多橋肽的其他例子，請參閱參考文獻33-36。這些方法可能會導致 Met 和 Trp 殘基氧化。
方法 15：MeSiCl3/Ph2SO 氧化31
- 將Cys-tBu肽溶於TFA (1 - 10 mg/mL)
- 加入Ph2SO (10 eq.), CH3SiCl3 (100-250 eq.) and anisole (100 eq.)
- 允許反應在 25 °C 下進行 10-30 分鐘
- 用 NH4F (300 eq.) 淬火反應，加入大量冷的二乙醚沉澱多肽並分離。通過離心
方法 16：TFA/DMSO 氧化32
- 將肽溶解在 TFA/DMSO/anisole (97.9/2/0.1) (2 mg/mL)
- 室溫攪拌 40 分鐘。再加入等分的 TFA/DMSO/anisole (40 microL/mg peptide)
- 在 70 °C 下加熱 3 小時，用乙醚沉澱多肽並離心分離。
不對稱二硫化物
S-Npys保護的肽在廣泛的pH範圍內與硫醇快速反應，形成混合二硫化物。37，使得此保護基團特別適合用於製備肽-蛋白結合物或由二硫橋結合的兩個不同鏈的肽38-41。然而，由於使用 Fmoc 化學時 Npys 基團對哌啶的不穩定性，通常使用 Boc-Cys(Npys)-OH 在肽的 N端引入 Cys(Npys) 殘基。 另外，已經發現 Npys 基團可以在合成後添加到任何 Trt 保護的 Cys 殘基上，方法是在標準的 TFA/TIS/water (95:2. 5:2.5) 中加入 5 個等效的 2,2'-二硫-雙（5-硝基吡啶）。5:2.5）裂解混合物42.
在Cys(Acm)和二硫桥存在的情况下，通过DPDS/硫代苯甲醚/TFA/TFMSA43处理，实现了Cys(tBu)到Cys(Pys)的直接转化。這種方法被用來提供活化的松弛素 A 鏈，它是合成類胰島素激素松弛素43的關鍵中間體。
方法 17：tBu 到 Pys 的轉換43
- 將 Cys-tBu 肽和 DPDS（4 eq.
- 混合物在冰上冷卻後，加入相近體積的 TFMSA in TFA (1:4 v/v)，並在 0 °C 下持續反應 45 分鐘。
- 用冷的二乙醚沉澱 Cys(Pys) 肽，並離心分離。用新鮮乙醚清洗沉澱物 4 次，以除去多餘的 DPDS。
二硫鍵的還原
使用 DTT 還原
自 W.W. Cleland44 推出以來，DTT（產品代碼 233153-M）已經成為胱氨酰肽還原的標準試劑。它的氣味很小，水溶性很高，在 pH 8 的水性介質中可定量還原二硫化物。
方法 18：用 DT 還原T
- 將肽溶於 0.1 M 碳酸氢铵（1-3 mg/mL）中。
- 加入 DTT（相对于硫醇基团过量 5 - 倍）。
- 用 N2 將混合物包覆並靜置 6 小時。
- 用 AcOH 將混合物酸化並凍乾。
- 使用凝膠過濾去除 DTT。
使用 TCEP 還原
TCEP 是一種水溶性膦，可在廣泛的 pH 值範圍 (1.5 -9.0)45 內還原二硫化物。與以硫醇為主的還原劑不同，TCEP 對氧氣不敏感，因此不需要特別的預防措施來排除空氣。此反應是不可逆且受動力學控制的，不像與 DTT 的反應是受熱力學控制的42。使用 TCEP 是還原縮氨酸的理想選擇，因為縮氨酸在 DTT 還原所需的 pH 8 下不溶解。
方法 19：用 TCEP 還原
- 將肽溶於任何合適的水/有機溶劑混合物（1-3 mg/mL，pH ）中。
- 加入 TCEP（相對於二硫化物，過量 5 倍）。
- 輕輕攪拌溶液 1 小時。
- 使用 HPLC 或凝膠過濾淨化還原肽。
埃爾曼測試
5,5'-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)與脂肪族巯基發生定量反應，生成黃色負離子。此反應可用於追蹤空氣氧化反應的進程。以適當的間隔從反應混合物中取樣，並測試硫醇含量46, 47。
方法 20：Ellman 測試
- 將 DTNB（40 mg）溶於 0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 8 (10 mL)。
- 从反应混合物中取样，用缓冲液稀释，得到 3 mL 含 0.1-0.2 µmole 肽的溶液。在多肽溶液中加入 DTNB 試劑 (0.1 mL)，靜置 15 分鐘。
- 在緩衝液（3 mL）中加入 DTNB 試劑（0.1 mL），製備參考液，測量吸光度。
- 使用以下公式計算巯基的濃度；[SH] = [A410（樣品）-A410（參考液）]/13650。
參考資料
參考資料
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