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多肽樹脂載入步驟

部分概述

相關資料

Merrifield 樹脂

Merrifield樹脂 (Product No.497061, 474517)可以按照 方法 1,1 中所述的方法加載 Boc-氨基酸，或者可以購買預先加載 C-末端氨基酸的產品。

Boc-amino-acids-merrifield-resins 附加物

方法 1：Boc-氨基酸附著於 Merrifield 樹脂

  1. 將 Boc-氨基酸溶於 EtOH (2 mL/mmol)，並加入水 (0.5 mL/mmol)。用 2 M aq.Cs2CO3。蒸發溶液至乾。加入二噁烷，蒸發至乾。使用二噁烷重複蒸發。
  2. 將 Merrifield 樹脂在 DCM 中預先攪拌 1 小時，然後用 DMF 洗滌。向樹脂中加入 DMF 中的 Cs 鹽 (1.2 eq.) ，並在 50 °C 左右加熱。加入 KI (0.1 eq.) 可催化反應。反應結束後，用 3X DMF、3X DMF/水 (1:1)、3X DMF、3X DCM、3X MeOH 沖洗樹脂。在 KOH 上真空乾燥。

羥甲基-官能化樹脂

方法 2）。2 然而，由於這種材料的基本特性，可能會產生對映体化和二肽的形成；其數量取決於所使用的 DMAP 的數量、反應的長度和氨基酸的性質。

羥甲基官能化樹脂

MSNT方法3,4 (方法3)是在困難情況下的選擇，例如HMBA樹脂的載入或附著易對映化的氨基酸衍生物時。5,6

半胱氨酸和組氨酸特別容易發生對映化，因此不應該使用此方法進行載入。對於這些殘基，建議使用 2-ClTrt 樹脂；C 端殘基的酯化不會產生對映体化和二肽的形成7 因為附著不涉及進入的受保護氨基酸的活化（方法 5）。

一旦樹脂被裝載，樹脂的取代可以很容易地使用 方法 11來確定。

方法 2：使用對稱酐附著到羥甲基樹脂上

  1. 將樹脂（1 g）放入乾淨、乾燥的燒瓶中，並加入足夠的 DMF，使其剛好覆蓋並膨脹 30 分鐘。
  2. 在乾燥的 DCM 中溶解 Fmoc 氨基酸（相對於樹脂負載為 10 eq.）。
  3. 向氨基酸溶液中加入二異丙基碳二亞酰胺（相對於樹脂載量為 5 eq.）在乾燥 DCM 中的溶液。
  4. 在 0 °C 下攪拌混合物 20 分鐘，用氯化鈣乾燥管保持反應混合物不受潮。
  5. 使用旋轉蒸發器在減壓下蒸發，除去 DCM。
  6. 將殘餘物溶解在最小量的 DMF 中，並將溶液加入步驟 1 中製備的樹脂中。
  7. 將 DMAP（相對於樹脂負載為 0.1 等量）溶解在 DMF 中，並將此溶液加入樹脂/氨基酸混合物中。
  8. 取出少量树脂样品（20 mg），使用方法 11 中描述的步骤进行洗涤、干燥并估算第一残留物的附着水平。如果得到的值小於 70%，則應該重複第一次殘留物附著程序。

    Method 3: Attachment to hydroxymethyl resins using MSNT/MeIm

    1. 將樹脂放入乾燥的反應容器中。膨脹並用 DCM 洗滌，加入足夠的 DCM 以覆蓋樹脂，然後用氮氣沖洗容器。
    2. 稱量適當的 Fmoc 氨基酸（5 等量）到乾燥的圓底瓶中。加入乾燥的 DCM 以溶解氨基酸衍生物（約 3 mL/mmol）；可加入一兩滴 THF 以幫助溶解。用氮氣沖洗瓶並密封。
    3. 使用注射器将氨基酸溶液转移到装有树脂的容器中。
    4. 将混合物在恒温条件下放置 1 小时，并轻轻搅拌。
    5. 用 DCM（5 次）和 DMF（5 次）洗涤。
    6. 取出少量树脂样品（20 mg），洗涤、干燥，并使用 Method 11 中描述的步骤估算第一残留物附着水平。如果得到的值小於 70%，則應該重複第一次殘留物附著程序。

    Loading amino- functionalized resins

    氨基酸官能化樹脂的加載氨基酸衍生物和其他羧酸與含有伯氨基的連結劑的附著通常可使用酰胺鍵形成的標準方法來影響（見 方法 4）。羥胺、Weinreb 酰胺和以仲胺官能化的樹脂則較難負載；對於這些樹脂，需要使用 HOAt/DIPCDI 或 HATU/DIPEA 活化。

    Method 4：羧酸附著到氨基樹脂上

    1. 用 DCM（聚苯乙烯基樹脂）或 DMF（PEG-PS 或 PEGA 樹脂）預濕樹脂 1 小時，然後用 DMF 徹底清洗樹脂。

      a) Rink Amide、Sieber Amide、MBHA

    2. 如果樹脂是 Fmoc 保護，則在 DMF 中用 20% 的哌啶處理 20 分鐘，然後用 DMF 徹底清洗樹脂。加入 DIPCDI (5 eq.) 並靜置 10 分鐘。將混合物加入樹脂。靜置 1-6 小時。

      b) N-烷基氨基樹脂

    3. 在 DMF 中溶解氨基酸衍生物或羧酸 (5 等式) 和 HATU。加入 DIPEA (10 eq.) 並立即加入樹脂中。

      取出少量樹脂，使用 TNBS 測試（伯胺樹脂）或氯苯胺測試（仲胺樹脂）檢測是否存在未反應的胺。如果結果呈陽性，則用 DMF 清洗樹脂並重複偶合。繼續此程序，直到獲得陰性結果。

    三苯甲基樹脂

    。

    與苯甲醇基支持物相反，Fmoc-氨基酸附著到三苯甲基樹脂上，如2-氯三苯甲基樹脂或NovaSyn® TGT樹脂不會產生對映体化，7 使其成為固定敏感殘基（如Cys和His）的理想選擇（方法5）。該樹脂還能保護 Cys 在延鏈過程中不被對映化。它們在合成 C 端脯氨酸肽時特別有用，因為三苯甲基連結體的體積有助於防止二酮哌嗪的形成8-10。

    NovaSyn® TGT 醇樹脂在附著氨基酸前，必須轉化為氯化物形式（方法 6）。

    NovaSyn® TGT 醇樹脂在附著氨基酸前，必須轉化為氯化物形式（方法 6）。

負載三苯甲基樹脂

Method 5: Loading of trityl resins

NOTE: 使用前務必乾燥所有溶劑和玻璃器皿。

羧酸的附著

  1. 溶解羧酸（0.6-1.2 eq.2-氯三苯酯树脂为 0.6-1.2 eq.，NovaSyn® TGT 氯化物树脂为 2 eq.）和 DIPEA（相对于羧酸为 4 eq.）溶于干燥的 DCM 中（每克树脂约 10 ml），如有必要，可加入少量干燥的 DMF（仅足以促进酸的溶解）。對於假脯氨酸二肽，加入 3 mL NMP/克樹脂。
  2. 將此加入樹脂中，攪拌 30-120 分鐘。對於假脯氨酸二肽，讓其待機反應。在這段時間結束時，用 3X DCM/MeOH/DIPEA (17:2:1)、3X DCM、2X DMF、2X DCM 清洗樹脂。在 KOH 上真空乾燥。Fmoc-amino acids 在使用前最好先從二噁烷中重複蒸發乾燥；使用 方法 11確定負載。

Method 6: Chloridation of NovaSyn® TGT alcohol resin

NOTE: 使用前務必乾燥所有溶劑和玻璃器皿。

  1. 將 NovaSyn® TGT 醇樹脂放入燒結玻璃漏斗中，用 DMF (2X)、乾燥 DCM (3X) 和乾燥甲苯 (3X) 連續清洗樹脂。
  2. 從樹脂中排出多餘的甲苯，並將潮濕的材料轉移到裝有回流冷凝器的圓底燒瓶中。在 60 - 70 °C 下加熱 3 小時。
  3. 將混合物攪拌到燒結玻璃漏斗中。用乾甲苯 (3X) 和乾 DCM (3X) 沖洗樹脂。
  4. 從樹脂中排出多餘的溶劑，並立即使用。

Dbz 樹脂

成功使用 Dbz 策略11 ； C端氨基酸殘基的選擇性酰化，並避免在鏈延長過程中未受保護的胺發生酰化。不完全的酰化會導致形成 C端截短的縮氨酸，因為在隨後的偶合週期中，任何未反應的胺都會進行酰化來延長新的鏈。而過度酰化則會形成支鏈肽，其鏈會從兩個連結胺上長出。因此，選擇附著 C末端殘基的酰化方法以及後續偶合對於獲得良好的結果至關重要（方法 7）。

Method 7: Loading of Dbz resins

  1. 將樹脂（0.1 mmol）在 DCM 中預先攪拌 60 分鐘，然後用 DMF 洗滌。在 DMF 中用 20% 的哌啶去除 Fmoc 基團，再用 DMF 洗滌。
  2. Ile、Val、Thr、Pro、Arg：加入 Fmoc-Aaa-OH (0.6 mmol)、HATU (0.6 mmol) 和 DIPEA (0.9 mmol)。輕輕攪拌 1 小時，用 DMF 洗淨樹脂，重複偶合。
    - Gly：加入 Fmoc-Gly-OPfp (0.6 mmol) 和 HOBt (0.6 mmol)。輕輕攪拌 1 小時
    - 其他氨基酸：加入 Fmoc-Aaa-OH (0.6 mmol)、HCTU (0.6 mmol) 和 DIPEA (0.9 mmol)。輕輕攪拌 1 小時。
  3. 使用 方法 11檢查負載。或者，用 DCM 沖洗樹脂樣品，然後用 95% TFA aq.

尤其有問題的是甘氨酸殘基的耦合，特別是如果它們出現在肽的 C端附近。如果使用脲或鏻活化，這種反應性高且無阻礙的氨基酸可以與游離的 Dbz-amino 基團耦合。在我們的經驗中，如果使用 Fmoc-Gly-OPfp/HOBt 來引入甘氨酸殘基，可以獲得最好的結果。一旦縮氨酸延伸超過 10 個殘基，這項預防措施可能就沒有必要了，因為障礙應該會降低未受保護的 Dbz 胺的反應性。此外，應避免使用 HATU 或 HCTU 等強效活化劑，因為使用這些活化劑可能會導致分支。

我們提倡使用 Alloc 保護來阻斷第二個胺基，以避免所有分支和截斷的問題12。所供應的 Dbz 樹脂大多含有 3-Fmoc-Dbz，以及少量的 4-Fmoc-Dbz 和雙-Fmoc-Dbz。因此，在移除 Fmoc 基團之前用 Alloc-Cl 封蓋樹脂，可將分支或截斷的最大潛在可能性降至 6%。對於受阻氨基酸，我們發現有必要在用 Alloc 封頂之前先將樹脂加載。在轉換成 Nbz 形式之前，必須先用 Pd(0) 裂離 Alloc 基團 (圖1)。

分配保護

圖 1： 在 Dbz 樹脂中避免分支的 Alloc 保護

氨基磺酰基樹脂

氨基磺酰基樹脂的裝填最好使用經 PyBOP® 活化的羧酸 。 和 DIPEA 在 CHCl3 -20 °C13 中活化，或使用 DIPCDI/N- 甲基咪唑（方法 8）。在 PyBOP® 活化的情況下，載入效率據報導從 Cys、Met 和 His 的 95% 到 Pro 的 44% 不等，這是最差的情況。使用這些方法載入 Fmoc-Phe 和 Fmoc-Leu 的消旋化程度分別為 0.5% 和 0.3%。然而，在實際應用中，這些方法所得到的負載量可能會有極大的變化，而且連結劑的過度酰化也可能會發生問題。此外，在開始多肽合成之前，必須先確定支持物的取代物。

氨基磺酰基樹脂

Method 8: Loading of sulfamyl resins

DIPCDI method

  1. 使用前將樹脂 (1 mmol) 在 DCM 中預先膨脹 1 小時。
  2. 將氨基酸衍生物或羧酸 (4 mmol) 和 1-MeIm (4 mmol) 溶於 DCM/DMF (4:1)。加入 DIPCDI (4 mmol)，混合並加入樹脂中。用 DMF、DCM、MeOH 沖洗樹脂，然後烘乾。

PyBOP® method

  1. 使用前將樹脂（1 mmol）在 CHCl3  中預先攪拌 1 小時。
  2. 將氨基酸衍生物或羧酸（4 mmol）和 DIPEA（8 mmol）溶於 CHCl3中。
  3. 將混合物冷卻至 -20 °C。加入 PyBOP® (4 mmol)，在 -20 ℃下輕輕攪拌靜置 8 小時。  用 DCM、DMF、DCM、MeOH 洗樹脂，然後烘乾。

DHP 樹脂

DHP HM 樹脂是由 3,4-二氫-2H14 附著在 100-200 目氯甲基聚苯乙烯上，是合成肽醇的有效工具。

相較於需要使用較長的反應時間和較高的溫度才能達到令人滿意的負載量的三苯甲基樹脂，DHP HM 樹脂的衍生化相對簡單，即使是仲醇也能輕鬆負載。通常，這個過程包括在吡啶鎓 p-甲苯磺酸鹽 (PPTS) 的存在下，在 DCE 中用過量的醇處理樹脂；完整的實驗細節請參見 方法 9。

Method 9: Loading DHP HM resin

  1. 在乾燥的 DCE 中預浸 DHP HM 樹脂 1 小時。
  2. 在含有 PPTS（1.5eq）的乾燥 DCE 中溶解 Fmoc-氨基醇（3eq），並將此溶液加入樹脂中。
  3. 在氮氣下輕輕攪拌，讓反應在 80 °C 下進行。
  4. 加入吡啶 (~ 5 mL/g)，使反應淬火。 ；過濾分離樹脂，並用 DMF、DCM 和己烷清洗。 ；在真空下將樹脂乾燥。

Preparation of peptide aldehydes using H-Thr-Gly-NovaSyn® TG resin

使用 H-Thr-Gly-NovaSyn® TG 樹脂來製備肽醛 ® TG樹脂15之間形成噁唑烷來固相固定氨基醛。

製備-肽-醛

裝入樹脂後，噁唑烷氮需用 Boc-酐處理封閉。

對於含有天冬氨醛、精氨醛、亮氨醛、苯丙氨醛或纈醛殘餘物的肽，可使用預載樹脂。

方法 10：載入 H-Thr-Gly-NovaSyn® TG 樹脂

  1. 將 H-Thr-Gly-NovaSyn® TG 樹脂懸浮在 1% AcOH in MeOH/DCM (1：1）中，將含有Fmoc-氨基醛（5 eq.
  2. 在恆溫下輕輕攪拌混合物 4 小時，並通過 TNBS 測試進行監測。
  3. 通過過濾除去樹脂，用 DCM、DMF 和 THF 進行清洗。
  4. 在 50°C 的 THF 中用 Boc2O (5 eq.) 和 NMM (5eq.) 處理樹脂 3 小時，使噁唑烷氮封頂。
  5. 過濾除去樹脂，並用 THF、DCM 和 DMF 洗滌

Fmoc 載量測試

為了估計用 Fmoc-amino acids 衍生化的樹脂的負載量，最簡單的方法是用 DBU 裂解 Fmoc 基團，然後用 U. V. 光譜測量釋放的二苯甲芴的溶液濃度。V. 光譜測量溶液中釋放出的二苯甲芴濃度。16

方法 11：第一殘留物附著水平的估算

  1. 取 3 x 10 mm 匹配的矽UV電池。
  2. 稱量乾燥的 Fmoc 氨基酸-樹脂（相對於 Fmoc 約 5 µmol ）到 10 mL 刻度瓶中。輕輕攪拌 30 分鐘。用 MeCN 將溶液稀釋至 10 mL。取 2 mL 此溶液在量瓶中稀釋至 25 mL。
  3. 如步驟 2 般製備參考溶液，但不加入樹脂。 注意：請勿交叉污染溶液。讓樹脂沉澱到比色池底部。
  4. 將比色池放入分光光度計中，在 304 nm 處記錄光密度。
  5. 根據以下公式估算第一殘留物的附著量 Fmoc 載量：mmol/g =(Abssample-Absref) X 16.4/mg樹脂)。

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