個別蛋白質的 3D 結構，以及其生物活性，在很大程度上取決於其組成氨基酸的主要序列。縮氨酸鏈形成有序結構的這種固有傾向，是縮氨酸組裝過程中遇到的合成效率高度序列特異性變化的主要原因。當勝肽伸長時，會形成次級結構，造成勝肽鏈聚集，導致反應速率降低。
在批次合成中，嚴重聚合的開始通常會透過樹脂基質的收縮來顯示，而在連續流合成中，則會透過去保護剖面的平坦化和寬度擴大來檢測。在這種情況下，通常使用茚三酮或 TNBS 進行的偶合測試通常不再可靠，而且可能會出現假陰性結果。
給定序列的組合難易程度通常難以預測，這也是多肽合成既有趣又具挑戰性的因素之一。含有連續疏水氨基酸（如 Ala、Val、Ile）的縮氨酸，以及含有可形成鏈內氫鍵的氨基酸（如 Gln、Ser 和 Thr）的縮氨酸，通常都很難合成。因此，一般而言，最好從一開始就採用可減緩結構形成影響的合成策略，而不是試圖猜測哪些肽可能有問題，並浪費時間和資源重複失敗的合成。
為了改善這個問題而開發的大部分方法，都試圖改善肽-樹脂複合物的溶解度。這些方法包括使用雙極性凍溶劑，例如 DMF、DMSO 或 NMP； ；混沌鹽； ；特殊的混合溶劑，例如 "Magic Mixture"； ；或 PEG。或 PEG 基極性樹脂，如 NovaSyn® TG、 NovaPEG 或 PEGA （表 1）。聚苯乙烯樹脂與 DVB 的交聯程度也會起關鍵作用，交聯程度不應高於 1%，否則會抑制適當的膨脹。 樹脂官能化是另一個重要因素，高負載樹脂會加重聚集的影響，正因如此，Novabiochem® 產品線為 Fmoc SPPS 最常用的支持物提供特殊的低負載版本。側鏈保護基團的選擇也會影響多肽的溶解。用 Trt 衍生物取代 Ser(tBu) 或 Thr(tBu) 或用 Lys(Tfa) 取代 Lys(Boc) 可以產生有利的效果。然而，提高合成效率的最普遍有效的方法是通過引入次級氨基酸代用品來可逆地保護關鍵殘基的酰胺骨架
有關如何識別和克服聚集效應的詳細討論，請讀者參閱 Quibell & Johnson 的出色文章10
。次級氨基酸代用品
次級氨基酸代用品是脯氨酸或 N-烷基氨基酸的類似物。仲胺基酸代用品是脯氨酸或 N-烷基胺基酸的類似物，它們是由標準的伯胺基酸經由骨架醯胺鍵的可逆性保護而衍生出來的。它們模仿脯氨酸和 N-烷基氨基酸的天然傾向，在肽組裝過程中破壞次級結構的形成。使用它們可以獲得更好、更可預測的酰化和脫保護動力學，從而提高粗產品的純度和溶解度，更容易進行 HPLC 純化，並提高產率，減少重複失敗合成的需要。事實證明，它們在合成難以合成的多肽、長肽/小蛋白質、環肽等方面特別有效，在很多情況下可以製造出原本無法製造的多肽。
Novabiochem目前提供三種仲氨基酸代用品： 假脯氨酸二肽; Dmb二肽; Dmb/Hmb氨基酸 (圖1)。在肽組裝之後，用反式脂肪酸（TFA）處理會裂解酰胺鍵保護基團，重新生成含有主氨基酸的原生序列，而主氨基酸正是次氨基酸代用品的來源。
圖 1.會破壞次級結構的 N- 烷基氨基酸。
圖 2.使用仲氨基酸代用品設計合成。使用仲氨基酸代用品的一般準則
- 如果氨基酸代理體在整個序列中相隔 5-6 個殘基，則可獲得最佳結果。
- 氨基酸代理體與 Pro 殘基之間的最佳間隔為 5-6 個氨基酸殘基。
- 一個氨基酸代理物與另一個氨基酸代理物或 Pro 殘基之間的最小間距為 2 個殘基。
- 在疏水殘基區域之前插入一個氨基酸代理物。
假脯氨酸二肽
Mutter的假脯氨酸二肽 無疑是最有效、最簡單的仲胺基酸替代物，但只適用於含 Cys、Ser 或 Thr 的序列。它們由二肽組成，其中的 Cys 殘基或 Ser/Thr 殘基已分別被可逆地保護成類似脯氨酸的 TFA-labile噻唑烷或噁唑烷。假脯氨酸殘基之所以以二肽的形式引入，是因為它避免了受阻噁唑烷氮進行酰化的需要。
這些二肽非常容易使用：只需用適當的假脯氨酸二肽（圖 3）取代肽序列中的 Cys、Ser 或 Thr 殘基以及前面的氨基酸殘基。原生序列會在裂解和去保護時再生。
以固定的間隔放置偽脯氨酸殘基已被證明是合成長肽和致淀粉樣蛋白肽的極為有效的方法。
在合成與 VEGF 受體 d2 domain 相關的 101mer 時，快速使用 7 個假脯氨酸二肽 合成了純度極高的 95 殘基多肽 同時還生產了泛素類似物，就是這種方法的例證。假脯氨酸二肽已使用鏻和氨活化試劑耦合，如 PyBOP®, HBTU, ；TBTU、 和 HATU 活化方法（方法 1a），以及碳二亚胺介导的偶联策略，如 DIPCDI/HOBt （方法 3-15a）。
在自動化儀器上，最簡單的方法是使用與任何其他氨基酸相同量的假脯氨酸二肽，因為這樣可以避免重新編程偶合週期或對合成進行任何手動干預。對儀器進行編程，添加 Cys、Ser 或 Thr 殘基，並記得從合成程序中省略下一個氨基酸的週期，因為這將作為假脯氨酸二肽的一部分被引入。
使用 5 倍過量的鏻或氨活化的假脯氨酸二肽來樹脂功能，偶合反應一般在 1 小時內完成。也可以使用較低的試劑過量，但建議使用胺測試（如 Kaiser 或 TNBS 測試）來檢查反應的完整性。
假脯氨酸中半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的再生發生在使用標準裂解雞尾酒（如 TFA/water/TIS (95:2.5:2.5)）進行 TFA 裂解反應的過程中，一般在 3 小時內完成。
圖 3.縮氨酸序列與假脯氨酸二肽之間的關係。
使用假脯氨酸二肽的協議
Method 1a：手動偶合偽脯氨酸 & Dmb 二肽
鏻/氨活化
- 將衍生物 (5 eq.) 和偶合試劑 (PyBOP®, TBTU, HBTU, HCTU, or HATU, 5 eq.) 溶解在最小容量的 DMF 或 HBTU 中。
- 加入 DIPEA（10 eq.）并充分混合。
- 立即加入到 Fmoc 保护的肽树脂中，并搅拌 1-2 h。通过 TNBS 测试检查偶联是否完成。
DIPCDI/HOBt活化
- 將衍生物（3 等份）和 HOBt（3 等份）溶於最小容量的 DMF/DCM (2:1)。
- 加入 DIPCDI (3 eq.)，充分混合。
- 靜置活化 10 分鐘，然後加到 Fmoc 保護的肽樹脂中，攪拌 1-2 小時。用 TNBS 測試檢查偶合是否完成。如果反應未完成，請延長偶合時間或使用新的試劑重複反應。
方法 1b：假脯氨酸二肽的自動偶合
使用盒裝乾燥 Fmoc-amino acids 的儀器
- 在空小瓶或盒中包裝適當 量的假脯氨酸或 Dmb 二肽，以符合儀器協議（即、
- 編程儀器以 Ser、Thr 或 Gly 殘基耦合二肽（1 h 耦合、HBTU、HATU 啟動）。
- 可以使用較小的二肽過量，但偶合試劑和鹽基試劑的遞送量需要在偶合協議中修改，以保持正確的二肽/偶合試劑/鹽基比例（1:1:2）。或者，可以將儀器編程為在去除 Fmoc 後的洗滌步驟後暫停，然後在反應容器中加入活化衍生物溶液，手動偶合二肽。
從試劑瓶中針對試劑溶液進行分配的儀器（ACT 396、Zinsser 350）
- 將衍生物溶解在 DMF 或 NMP 中，使其濃度與試劑瓶中標準 Fmoc- 氨基酸衍生物的濃度完全相同。
- 將含有二肽的試劑瓶放置在自動取樣器支架的適當位置。
- 編程儀器將二肽作為Ser、Thr或Gly殘基耦合（1小時耦合，HBTU、HATU活化）。省略下一個氨基酸的氨基酸循環。
使用帶專用溶劑管路的 Fmoc 氨基酸儲備溶液的儀器（Protein Technologies Symphony）
雖然在 Symphony 等儀器上使用預先溶解的假脯氨酸二肽溶液是完全可行的，但這會造成相當大的浪費，因為試劑溶劑管路在使用前需要用二肽溶液引導。對於這類儀器，應將循環編程為在去除 Fmoc 後的清洗步驟後暫停，並將循環中的 「添加 」氨基酸和偶合試劑步驟更換為 「不添加 」試劑步驟。然後，可以在反應容器中加入活性衍生物溶液，手動偶合二肽。
Dmb dipeptides
Dmb dipeptides work exactly the same way and offers many same benefits as pseudoproline dipeptides but for Gly containing sequences i...Dmb二肽的工作方式與假脯氨酸二肽完全相同，並提供許多相同的優點，但適用於含甘氨酸的序列，即更快、更可預測的酰基。例如，更快、更可預測的酰化反應，更高的粗品產率和純度，以及更少的合成失敗。
使用二肽非常簡單，只需用適當的二肽（圖 4）取代肽序列中的甘氨酸殘基和前面的氨基酸殘基。
為了在使用Dmb二肽時獲得最好的結果，最好遵循 圖2中列出的指南。Dmb二肽可以使用任何標準偶合方法引入。
圖 4.Dmb 二肽的使用原則
Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH對於改善含有常見的Gly-Gly基序的肽的合成特別有用。由於此類肽有聚集的傾向，且難以分離洗脫密切的 desGly 副產物，因此生產此類肽時常會遇到問題。在肽序列中插入 Gly-(Dmb)Gly 對合成效率的益處與假脯氨酸二肽相同，可防止聚集並改善酰化和脫保護動力學。
Ala-Gly二肽序列常見於疏水性跨膜肽和致淀粉樣蛋白肽中。因此，Fmoc-Ala-(Dmb)Gly-OH 應該被證明是合成這類多肽的有用工具。
對於含有 Asp-Gly 基序的多肽，強烈推薦使用 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH，因為使用它來引入 Asp-Gly 二肽可以完全防止天冬氨酰胺的形成。
Dmb/Hmb 氨基酸
與之前描述的假脯氨酸和 Dmb 二肽不同，這些衍生物是用來單獨引入受骨醯胺保護的殘基，而不是作為二肽。
使用這些氨基酸衍生物，就不會像二肽衍生物一樣，只能在 Gly、Ser 或 Thr 殘基上引入骨架醯胺保護。
Sheppard及其同事設計了他們的Hmb衍生物來緩解這個問題。 緊接在 Hmb 保護之後的氨基酸加成，最初是透過內部鹽基催化捕捉酰基成分，得到苯基酯，然後緩慢地進行分子內 O→N 酰基轉移，得到所需的叔胺（圖 5）。一般而言，(Hmb)Gly 的酰化過程簡單直接，對大多數胺基酸而言，大多數的偶合方法都能順利進行。對於其他 Hmb 殘基，Sheppard 及其同事發現在 DCM 中使用 PSAs 或 Fmoc N- 羧酸酐的效果最好。其他作者也發現 TBTU/HOBt/DIPEA 活化和胺基酸氟化物 也很有效。實際上，當側鏈變得更龐大時，耦合會變得更困難，而進入的胺基酸的固態阻礙會變成越來越重要的因素。使用酸性氟化物，最困難的情況是將 Fmoc-Val 加到 (Hmb)Val 中，在 80 °C 的甲苯中過夜進行偶合，產率可達 95%。儘管有這些限制，Hmb 衍生物已被證實對各種困難的聚合肽非常有效。
圖 5.Hmb 保護殘基的酰化機制。
(Hmb)Gly和(Dmb)Gly在合成疏水性淀粉樣蛋白和跨膜肽方面具有特殊的應用。使用傳統方法製備這些序列極為困難，而且由於這些序列很少包含多個絲氨酸或蘇氨酸殘基，因此通常無法進行假脯氨酸取代。然而，甘氨酸卻經常出現在這類肽中，通常與疏水殘基（如 Ile、Val 和 Ala）相鄰。因此，以 (Dmb)Gly 或 (Hmb)Gly 取代 Gly 應該是克服這些問題的有效方法。事實上，Bayer 及其同事使用類似 (Tmob)Gly 衍生物的六個取代物，就能以極佳的純度製備出 64 位元的跨膜多肽。
Fmoc-(Dmb)Gly-OH 的耦合可以使用 PyBOP®/DIPEA 等標準方法來實現。用哌啶/DMF 去除 Fmoc 之後，甘氨酸仲胺可以用 PyBrOP® 或 HATU 單次偶合，或使用預先形成的氨基酸氟化物，與 Fmoc- 氨基酸進行酰化。 在需要合成後酰化或磷酸化的應用中，(Dmb)Gly 較 (Hmb)Gly 優勝，因為 Dmb 基團缺乏潛在的反應性羥基官能度。
去保護
在肽的最終裂解和去保護所需的正常條件下，Dmb 和 Hmb 基團會被去除。但是，我們建議在裂解混合物中加入約 2% 的 TIS。
注意：Dmb 和 Hmb 的裂解產物會造成未保護 Trp 的側鏈修飾。因此，我們強烈建議在所有使用這些基團的合成中使用 Fmoc-Trp(Boc)。
聚合序列的溶解
圖 6.Ac-Hmb 保護多肽的合成。
參考資料
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？