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Fmoc 樹脂裂解和脫保護

目錄

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引言

在成功合成受保護的多肽後，我們面臨一項艱巨的任務，即必須同時使多肽脫離樹脂支持物，並去除所有氨基酸殘基的側鏈保護基團，以獲得所需的多肽。在 Fmoc SPPS 中，這一步驟通常是用反式脂肪酸處理肽樹脂。在此過程中，高活性的陽離子物質會從保護基團和樹脂上的把手產生，這些物質除非被截留，否則會與含有親核官能基團的殘餘物發生反應，從而修飾這些殘餘物：Trp、Met、Tyr 和 Cys。為了防止這種情況發生，我們會在 TFA 中加入各種親核試劑（稱為清除劑）來淬滅這些離子1, 2

許多通用的裂解混合物已被提倡，其中最流行的是 Reagent K (TFA/water/phenol/thioanisole/EDT [82.5:5:5:5:2.5])1.然而，隨著保護基團和連結劑技術的進步，特別是 Fmoc-Trp(Boc) 和 Fmoc-Arg(Pmc/Pbf) 衍生物的問世，除了特殊情況外，這種含有毒性和惡臭試劑的複雜混合物已不再需要。

通過適當選擇受保護的氨基酸衍生物和樹脂（表 1），大多數問題都可以得到改善。  如果遵循這些建議，使用 TFA/TIS/water (95:2.5:2.5) 對大多數序列來說就足夠了。當然，有些序列，尤其是那些含有半胱氨酸和大量受丁基保護殘基的序列，這種混合物無法提供令人滿意的結果；在這些情況下，建議在混合物中加入 EDT 或使用試劑 K。

儘管如此，作為一般的非氣味裂解雞尾酒，此混合物已證明非常有效。

對於那些不想使用表 1中的建議的人，圖 1中的流程圖將有助於選擇最合適的混合物。

表 1：建議的保護群組和樹脂策略。

去除 N 端 Fmoc 基團

在進行肽樹脂酸裂解之前，必須使用哌啶去除 N 端 Fmoc 基團。請參閱您合成器的說明書；許多合成器會自動將去除 N 端 Fmoc 基團編程為合成的最後一步。

為裂解準備肽樹脂

肽樹脂應徹底清洗，尤其是合成過程中使用 DMF 時，因為 DMF 不揮發，殘留的基本 DMF 對 TFA 酸解有明顯的抑制作用。對於以 PEG 和聚丙烯酰胺為基礎的支持物，最好使用不會造成勝肽釋放的弱酸性試劑 (例如醋酸) 進行清洗，因為這些類型的樹脂容易吸附 DMF3。

注意：乙酸不能用於清洗對酸極為敏感的 Rink acid、TGT 或 2-chlorotrity 樹脂。

方法 1：製備用於裂解的肽樹脂

  1. 將肽樹脂放入燒結玻璃漏斗中，並施加一些吸力。
  2. 先用 DMF、醋酸清洗，再用 DCM 清洗幾次。用 MeOH（聚苯乙烯）或醚（聚丙烯酰胺）進一步清洗，使樹脂收縮。
  3. 取出多肽樹脂，在高真空下乾燥 4 小時，或最好在 KOH 上乾燥 4 小時。

TFA 裂解和脫保護

最佳的裂解條件在很大程度上取決於存在的各個氨基酸殘基、其數量和順序、側鏈保護基團以及附著在樹脂上的連結劑類型。

由於不同肽樹脂的行為存在差異，建議使用 20-50 mg 樣品對肽樹脂進行初步小規模裂解，以確定最佳裂解條件，例如清除劑的選擇和反應長度。

這將有助於確定裂解的程度（例如，在適當的情況下，通過定量分析連接到連結體上的參考氨基酸）和粗裂解肽的質量（通過 HPLC 和氨基酸分析）。對於大多數的多肽，只要遵循 表1 中給出的建議，用TFA/TIS/水（95:2.5:2.5）就可以影響裂解。  在發生問題的情況下，使用試劑K，或者在上述混合物中添加EDT，通常可以提供令人滿意的解決方案。

就 Rink Amide 樹脂而言，連接手柄和樹脂的苯基苄基醚鍵對酸敏感，可能會被斷裂，尤其是在裂解反應期間產品釋放緩慢的情況下，會產生有色的副產品，這些副產品不容易通過簡單的水洗從產品中去除。 使用 方法 3中概述的 2 步程序可以避免這種情況，使用矽烷清除劑則效果更佳。

蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸极易被裂解过程中产生的阳离子烷基化。色氨酸、蛋氨酸或半胱氨酸與 t-丁基陽離子反應會導致產品肽的修飾；與連結陽離子反應會使肽不可逆地重新附著到樹脂上3。與蛋氨酸會發生進一步的反應，產生高絲氨酸和縮氨酸鏈的碎裂。透過在裂解混合物中加入清除劑，這些副反應可被大幅抑制。其中一個例外是在 Mtr、Pmc 和 Pbf 受保護的精氨酸殘基4裂解時所形成的產品對色氨酸的磺化作用。幸運的是，使用 Fmoc-Trp(Boc)5-8可以消除這個副反應。這種衍生物也能抑制 C端 Trp 殘基與樹脂連結處所產生的陽離子再連結。以磺酰基為基礎的保護基團也被證實與形成 N-磺化Arg9 和 O--磺化Ser和Thr10有關。

最常用的清除劑是 EDT。它不僅是 t-丁基陽離子的極佳清除劑，還能協助去除半胱氨酸的三苯甲基保護基，對於防止色氨酸殘基的酸催化氧化特別有效。

在清除劑混合物中加入乙基甲基硫醚 (EMS)、EDT 或硫代茴香醚可抑制酸催化的 Met 氧化；雖然在氮氣下進行裂解反應、確保產品沉澱只使用不含過氧化物的乙醚，以及所有溶劑在使用前都經過徹底脫氣，但仍可將蛋氨酸亞硫醚的形成降至最低。硫代苯甲醚也可加速 TFA 中 Arg(Mtr/Pmc/Pbf) 的移除；然而，使用此種試劑時最好小心，因為有證據顯示它可能會造成 Cys 殘基上的 Acm、tButhio 或 tBu 保護基團部分移除11.

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fmoc-flow

圖 1： 為 Fmoc SPPS 選擇裂解雞尾酒的流程圖

苯酚被認為可為Tyr和Trp殘基1提供一些保護。Trialkylsilanes (例如 TIS 和 TES) 已證明是 EDT12 有效且無臭的替代品，尤其是對於含有 Arg(Pmc) 和 Trp(Boc)5, 8 的縮氨酸。這些試劑也能非常有效地淬滅在Trt 12、Tmob13, 和Rink Amide連結物裂解時釋放出來的高度穩定陽離子，因此當這些分子存在時，強烈建議使用這些試劑。

當多肽中存在數個較不耐酸的保護基團，或是多肽較長，因此包含許多保護基團時，通常需要大幅延長裂解時間。與 PMC 或 Pbf 基團相比，Mtr 基團的酸鹼度較低，完全去除需要長達 24 小時。在 Trp 含有數個 Mtr 保護基團的情況下，透過 HPLC 監測此保護基團的去除情況，對於最佳化裂解條件是非常有用的。需要在部分色氨酸修飾的縮氨酸與 Arg(Mtr) 的不完全脫保之間作出折衷。因此，對於含有 Trp 的肽，強烈建議使用 Trp(Boc)-derivatives 來避免色氨酸側鏈的修飾。

對於長肽，可能需要使用較長的裂解時間來完全去除所有側鏈保護。如果在 6 小時內仍無法完全解除保護，則應使用乙醚沉澱多肽，並使用新的試劑重複裂解。應進行裂解測試，以找出最佳的裂解機制。

在合成長肽時，側鏈脫保護不完全往往被忽視為失敗的原因。

Method 2: General TFA cleavage

注意：TFA 是一種腐蝕性極強的液體；使用此試劑時必須非常小心。必須穿戴適當的護眼用品、白褂和手套。請遵守當地、州/省及聯邦的安全規定。

  1. 將乾樹脂放入燒瓶中，加入含有適當清除劑的 TFA 溶液（10-25ml/g 樹脂，圖 1）。注意：應該進行計算，以確保存在的肽和保護基團的質量有足夠的清除劑。蓋上瓶塞，靜置於恆溫室，間中攪拌。反應時間取決於順序（參見下文 「監測裂解反應」）。
  2. 減壓過濾，去除樹脂。用反式脂肪酸清洗樹脂兩次。合併濾液，並加入（逐滴加入）8-10 倍體積的冷乙醚。有時必須蒸發大部分的 TFA，才能使粗肽有良好的沉澱效果。
  3. 如 方法 17所述分離多肽。

Method 3：Rink 酰胺樹脂的脫離/防腐的兩階段程序

  1. 將樹脂在 10% TFA 加入 DCM 中漿化，倒入玻璃漏斗中，細燒結。
  2. 讓溶劑慢慢滲透樹脂床。用 5% TFA 沖洗樹脂，讓其緩慢滲透樹脂床。脫離是一種酸催化平衡，因此使用這種流動方法不斷去除脫離的肽是很重要的。在燒瓶中進行反應無法達到完全脫離。
  3. 在減壓下除去過量的 TFA/DCM，並根據氨基酸組成（見 圖 1），用 95% 的 TFA 加清除劑完成脫保。

監測裂解反應

肽中存在 Mtr 保護的精氨酸時，需要根據所使用的清除劑的選擇（圖 1），進行 3 到 6 小時不等的長時間反應。多個精氨酸殘基可能需要延長反應時間至 24 小時。在這種情況下，透過 HPLC 監測此保護基團的移除情況來優化裂解條件是非常有用的。

涉及到強酸的一般方案

作為 TFA 的替代方案，為了快速解除對 Arg(Mtr/Pmc/Pbf)、Asn(Mbh) 和 Gln(Mbh)等較不耐酸的側鏈保護基團的保護，可使用較強的酸和適當的清除劑，且不會有副反應的報告。

使用溴化三甲基硅烷進行樹脂裂解14

通常發現，要完全解保護含有多個 Arg(Mtr) 殘基的縮氨酸，需要很長的裂解時間，這可能會導致產品品質嚴重下降。尤其是含色氨酸的勝肽長時間曝露於 TFA 中的 EDT，會因二硫代酮的形成而導致色氨酸殘基的修飾。使用溴化三甲基硅烷基 (TMSBr) 進行裂解可消除這些問題，因為這種試劑已被證實可在 15 分鐘內乾淨地去保護多達 4 個 Arg(Mtr) 殘基。此外，即使使用未保護的色氨酸，此方法也能完全抑制磺化副產品的形成15。

Method 4: Cleavage with TMSBr

  1. 將 TMSBr (1.32 ml）加入冷却至 0°C 的 EDT（0.50 ml）、间甲酚（0.1 ml）和硫代苯甲醚（1.17 ml）在 TFA（7.5 ml）中的溶液中。加入肽樹脂 (200 mg)，讓混合物在一層 N2 0°C 下靜置 15 分鐘。用清潔的反式脂肪酸洗滌樹脂兩次。合併濾液，加入（滴加）8-10 倍體積的冷乙醚。有時需要蒸發大部分的反式脂肪酸，才能使粗肽有良好的沉澱效果。
  2. 如 方法 17所述分離多肽。

注意：偶爾需要使用氟化銨對多肽進行額外處理，以逆轉可能已發生的任何硅化作用。

從對酸非常敏感的樹脂中裂解

林克酸樹脂16、2-氯三苯基膦17、HMPB18、NovaSyn TGT19、 和 Sieber 樹脂20 含有高度酸敏感的連結劑，適用於合成受保護的多肽。

HMPB樹脂& Sieber酰胺樹脂

從HMPB連結劑21 可生成完全保護的肽酸，從Sieber酰胺樹脂20可生成保護的酰胺。然而，若要避免過早失去側鏈保護基團，則必須小心謹慎地進行實驗。用 1% 的 TFA 在二氯甲烷中的溶液重複處理肽基樹脂，並配合最短的反應時間，可以得到最好的結果。

理想情況下，裂解應在可密封的燒結玻璃漏斗中進行，以防止高揮發性的 DCM 揮發，過濾時應施加氮氣壓力，而不是使用真空。

如果肽含有 Met 或 Trp，則應在裂解混合物中加入 1% EDT，以防止肽再次附著。

如果肽含有 C 端 Trp 殘基，則強烈建議使用 Trp(Boc)21.

在這個分批進行的程序中，酸的強度會逐步增加，這取決於存在的 TFA 緩衝基團的數量。肽的最大濃度可包含在第一次或後來的一次洗滌中，這取決於存在的酰胺鍵和其他官能基的緩衝能力。在此過程中， t-丁基類型的側鏈保護基團以及 Trt（在 Asn 和 Gln 上）會保持完全完整21。

Method 5: Cleavage with dilute TFA

  1. 在可密封的燒結玻璃漏斗中用 DCM 預先浸泡乾樹脂 (1 g)，並去除多餘的 DCM。
  2. 在乾燥的 DCM（10 毫升）中加入 1% 的 TFA，密封漏斗，搖晃 2 分鐘。
  3. 重複步驟 2 最多 10 次，用 3 x 30 ml DCM、3 x 30 ml MeOH、2 x 30 ml DCM、3 x 30 ml MeOH 沖洗樹脂上殘留的受保護多肽，並用 TLC 或 HPLC 檢查濾液。
  4. 將含有產品的濾液混合，並在減壓下蒸發至體積的 5%。向殘餘物中加入水（40 ml），用冰冷卻混合物以幫助產品沉澱。
  5. 通過燒結玻璃漏斗過濾分離出產品。用清水清洗產品三次。在乾燥器中真空乾燥樣品，先在 KOH 上乾燥，後在 P2O5 上乾燥。

2-氯三苯甲基、NovaSyn® ；TGT 和 NovaPEG Trt 樹脂

2-Chlorotrityl17, NovaSyn® TGT19和NovaPEG Trt樹脂可如上所述用1% TFA裂解，或在較溫和的條件下用AcOH或TFE 22 產生受保護的多肽。在製備保護肽時，特別建議使用 Fmoc-His(Clt)-OH 來引入組氨酸。

Method 6: Cleavage with TFE/DCM

1.   用 TFE/DCM (2:8) 處理多肽樹脂 3 x1 h。

2.   適當時間後，過濾去除樹脂，用裂解混合物洗 3 次。

在此過程中，我們將進行一系列的實驗，以測試裂解的完整性。裂解的完整性可透過濾液的 TLC 檢查。透過矽膠低壓層析、苯基矽膠 HPLC 或重結晶進行純化。

由 HMBA 和肟連接器連接的肽

對於肽羧酰胺的合成，HMBA 連接器已基本上被 Rink Amide 類型的連接器所取代。儘管如此，這種連結劑仍是勝肽-樹脂連結劑中最有彈性的一種。多肽可以用許多不同的親核劑從連結劑中釋放出來，從而得到在 C 端具有各種官能基團的多肽3, 22 -25 (Table 2)。這些方案也與 Boc SPPS 中使用的肟連結劑相容。

表 2：HMBA 連結劑裂解產生的產品。

方法 7：甲醇氨水裂解得到肽酰胺3, 23

  1. 將乾樹脂放入燒瓶中，加入 95% 的反式脂肪酸水溶液 (20 ml/g)。蓋上燒瓶，在恆溫下放置 1 小時，間中攪拌。
  2. 在減壓下通過過濾分離樹脂，並用反式脂肪酸洗滌。丟棄濾液。用 DCM、10% DIPEA in DCM、DCM 洗樹脂。  在 P2O5 o/n 真空下乾燥樹脂。
  3. 將乾燥的樹脂放入乾淨、乾燥的壓力容器中，並放入足夠的 DMF 使樹脂膨脹，然後再放入 0°C 下的乾燥甲醇飽和氨溶液 (20 ml/g)。靜置 18 小時，然後再次將燒瓶冷卻至 0°C。小心打開已冷卻的容器，將樹脂通過燒結玻璃漏斗過濾。
  4. 先用甲醇清洗樹脂，然後將樹脂放入另一個燒瓶中用反式脂肪酸清洗，以除去甲醇不溶的多肽。
  5. 將濾液分別在旋轉蒸發器上蒸發至乾。

注意：如果在進行此裂解程序之前沒有徹底乾燥肽樹脂，則可能會獲得肽酸作為副產品。

Method 8： 用肼裂解，得到 C 端肼24

如果需要，應按照 方法 7，步驟  1 & 2 首先去除側鏈保護基團。

  1. 將肽樹脂懸浮於 DMF 中，並加入 DMF 中的 5% 水合肼溶液 (20 ml/g)。
  2. 將樹脂通過燒結玻璃漏斗過濾，先用 DMF 洗樹脂，然後用 TFA 洗樹脂，將樹脂倒入另一個燒瓶中，以除去 DMF 中不溶解的多肽。用乙醚沉澱多肽，然後過濾分離出多肽。

Method 9： 用鹼溶解，得到游離酸3

首先應使用 方法 7 步驟 1 & 2去除側鏈保護基團。

  1. 將樹脂預先浸泡在二噁烷中。
  2. 在冰/水浴中將 0.1 M NaOH/ 二噁烷 (1:3, 20 ml/g) 冷卻至 0°C。
  3. 使用玻璃燒結漏斗將樹脂過濾到盛有 0.1 M HCl (5 ml/g)的燒瓶中。此燒瓶應在冰浴中冷卻，以防止基溶液中和時升溫。
  4. 用水清洗樹脂，並將濾液的 pH 調至 7.0。凍結濾液，並以凝膠過濾法除去氯化鈉。

Method 10： 使用甲醇/DIPEA進行裂解，得到甲酯24

應首先使用 方法 7，步驟 1 & 2 去除側鏈保護基團。

  1. 將樹脂放入乾淨的燒瓶中，並加入足夠的 DMF 使樹脂膨脹。
  2. 先用MeOH/DMF清洗樹脂，然後在另一個燒瓶中用TFA清洗樹脂，以除去甲醇不溶的多肽。
  3. 在旋轉蒸發器上分別蒸發濾液至乾。

如果產率低，請在 50°C 下使用新的試劑重複反應。

Method 11: 用硼氢化物分解得到肽醇25

此方法僅適用於 TG 和 PEGA 類樹脂。

側鏈保護基應先使用 方法 7，步驟 1 & 2去除。

  1. 用 50% aq. EtOH 處理縮氨酸樹脂（1.0 g），並讓其排出。在 3 ml 50% aq. EtOH 中加入 NaBH4 (126 mg)，輕輕攪拌 4 小時。
  2. 過濾除去樹脂，用 50% aq. EtOH (40 ml) 洗滌，得到 pH~9 的多肽溶液。

在從 HMBA 衍生化樹脂上裂解多肽之前，必須先去除側鏈保護基團，尤其是當多肽含有 Asp 或 Glu 時。這可以用 95% aq. TFA 處理多肽樹脂來達成。如果肽含有 Arg(Mtr)，最好在用試劑 K 處理的附加步驟中將肽從樹脂上裂解後再去除 Arg 殘基。

磺酰胺基丁醯基樹脂附著的勝肽，產生硫代酯

硫代酯的合成

圖 2：使用氨基丁酰基磺酰基樹脂合成硫代酯

方法 12：用氨基磺酰基樹脂進行硫酯結合

酰基氨基磺酰基樹脂的活化

  1. 將樹脂（0.1 mmole）於乾燥 THF 中，注入裝有 20 mm 聚乙烯過濾器的 10 ml 聚丙烯注射器中。
  2. 在乾燥己烷/THF（1:1）中加入 5 ml 1 M TMS-CHN2   蓋上注射器蓋子。
  3. 輕輕地混凝 2 h。  用 THF 清洗樹脂並馬上使用，或者用 THF 清洗，然後用 DCM 並真空乾燥。

硫酯的裂解

  1. 使用前將甲基化的樹脂在 DMF 中預先攪拌 1 小時。
  2. 加入 3-巯基丙酸乙酯 (50 eq.)和噻吩氧化鈉 (0.5 eq.)，蓋上注射器並輕輕攪拌混合物 24 小時。
  3. 合併濾液，並在旋轉蒸發器上蒸發至乾。
  4. 用乙醚將產品粉碎。
  5. 用 TFA/water/TIS /phenol (88:5:2:5) 處理殘餘物，於恆溫下放置 2 小時。
  6. 將裂解液逐滴加入 10 立方米乙醚中，使用標準方法通過過濾或離心分離產品。

連接未受保護的肽片段

  1. 將肽硫酯（1 eq.）和 N--terminal-Cys 肽（1 eq.）溶解在含有脫氣 0.1 M 磷 酸鈉緩衝液（pH 7.8）的螺旋蓋管中。
  2. 加入噻吩酚（總溶液體積的 1%），用氮氣沖洗，蓋上管蓋，用力攪拌混合物。可使用 HPLC 監控反應進度。反應通常在 5-16 小時內結束。
  3. 用 TFA（溶液體積的 0.1%）酸化反應物，以標準程序進行凍結及純化。

肼基苯甲酰樹脂附著的肽

芳基肼氧化生成的芳基二氮烯在溫和條件下容易分解生成烷和氮32。這個過程已被 Millington, et al 所利用。33 作為新型安全捕捉連結劑的基礎， N-Fmoc-4-肼基苯甲酸（圖 3），可連接到 NovaGel™ 樹脂上。

Method 13： 肼基苯甲酰樹脂的氧化裂解

使用 Cu(II) 氧化得到酰胺類

  1. 將樹脂懸浮在純胺中
  2. 加入 Cu(OAc)2 (0.5 eq.)，並在樹脂中強力鼓氣 4 小時。
  3. 過濾除去樹脂，並用 DCM 洗滌。在 DCM 中重新溶解，然後用 1 M KHSO4、水和饱和 NaCl 洗滌。
  4. 將有機層置於 Na2SO4  並蒸發至乾。

使用 NBS34

  1. 將樹脂懸浮在乾燥的 DCM 中
  2. 加入 NBS (2 等份) 和乾燥的吡啶 (2 等份)。輕輕攪拌 5 分鐘。
  3. 過濾除去樹脂，並用乾燥 DCM 和乾燥 THF 洗滌。
  4. 將樹脂重新懸浮於乾燥 DCM 中，加入醇或胺（5 eq.
  5. 過濾除去樹脂，並用二氯甲烷洗滌。
  6. 蒸發合併濾液至乾。
應用-FMOC-4-肼基苯甲酰樹脂

圖 3：Fmoc-4-肼基苯甲酰樹脂的應用。

移除 Fmoc 基團後，樹脂結合的肼基團可使用標準偶合方法輕易進行酰化。

在溫和的氧化條件下，可在醋酸銅 (II) 和吡啶 (或 DBU) 的存在下，用空氣和適當的親核體處理來進行裂解，以提供含有一系列羧基修飾（如酸、酯和酰胺）的產品。

另外，該反應可以分兩個階段進行，首先用 NBS 氧化生成重氮，然後在移除過量氧化劑後用親核劑進行裂解。此方法的優點是可避免產品受到銅污染。在合成伯醇和仲醇的酯時，Peters & Waldmann34  發現 NBS 活化法的產率最高。Camarero 及其同事也使用此方法來製備肽對硝基苯胺35 和肽硫代酯 36 36 採用對硝基苯胺和氨基酸硫代酯作為親核體。

這種樹脂也被用來制備環肽 通過 涉及重氮37上的N-末端氨基的分子內攻擊的環狀裂解策略 N-末端氨基的環狀裂解策略 37。

最近有人評論了 Fmoc- 肼基苯甲酰樹脂的使用。38

附著在 Dbz 樹脂上的多肽

39, 40 （見 圖 4）來處理肽硫酯和硫酯替代物。

在裂解之前，Dbz 分子需要根據 方法 14轉換為活化的 Nbz。該反應通常是定量的。對於高負載樹脂（如 Dawson Dbz AM 樹脂），可能會發生一些 Dbz 分子的交聯。根据我们的经验，使用低负载树脂（如 Dawson Dbz NovaSyn® TGR 树脂）可获得更清洁的结果。用 TFA 處理 Nbz 樹脂可釋放出完全脫保護的多肽-Nbz，可直接用於 NCL 反應。Nbz 多肽是以攝取異構體混合物的形式獲得的。

合成肽硫酯

圖 4：使用 Dbz 樹脂合成肽硫代酯。

方法 14：使用 Dawson Dbz AM 樹脂進行硫酯結合

合成 & 活化

  1. 使用 HBTU/HOBt/DIPEA 活化來延長肽鏈，除了 Gly 應該使用 Fmoc-Gly-OPfp/HOBt 來引入。N 端殘基必須使用 Boc- 氨基酸導入。用DMF和DCM洗涤树脂。
  2. 在DCM中加入对硝基苯基氯甲酸酯（0.5 mmole），在N2下轻轻搅拌1小时。用DCM洗涤树脂，在DMF中加入0.5 M DIPEA（10 ml），静置30分钟。
  3. 用TFA/水/TIS 95:2.5:2.5溶解多肽3小時。

連接未保護的多肽片段

  1. 溶解純化的多肽-Nbz（1 eq.) 和 N-terminal-Cys 多肽 (1.5 eq.) 溶解在含有脫氣結合緩衝液 (0.2 M 磷酸緩衝液、6 M 鹽酸胍、0.2 M 4- 巯基苯乙酸、0.02M TCEP、pH 7.0) 的螺旋蓋管中。多肽的最終濃度應約為 2 mM。
  2. 以 HPLC 監控反應進度。
  3. 以 TFA（溶液體積的 0.1%）酸化反應物，以標準程序進行凍結及純化。

肽醛類

製備肽醛類的方法主要有三種：第一，氧化適當的肽醇41；第二，還原肽的羧酸衍生物，例如Weinreb酯42, 43；第三，還原肽的羧酸衍生物42, 43。(見 方法 15）；最後，使用預先形成的遮蔽醛44進行分步合成或片段合成（見 方法 16）。

附著在 Weinreb 樹脂上的多肽

還原N-甲氧基-N-4 或 DIBAL 還原甲基醯胺 (Weinreb amides)，是製造勝肽和 a-amino-aldehydes42 的成熟策略。Fehrentz 及其合作者43將這種方法改良用於 SPOS，方法很簡單，就是將 Weinreb 胺的 N- 甲基換成連結劑，讓甲氧基胺可以附著在固體支持物上。

由於樹脂結合的仲胺具有受阻性，因此應使用 HOAt/DIPCDI 或 HATU/DIPEA 來添加第一個殘餘物（方法 4）。所得到的支持物對 Fmoc 和 Boc SPPS 的條件很穩定。 在用 LiAlH4 還原之後，Fehrentz, et al. 報告得到多肽醛的產率為 30-40%。

方法 15：Weinreb 酰胺的還原裂解

為了防止與某些氨基酸側鏈官能性產生副反應，通常建議保留所有保護基團；但肽含有 Asp 和 Glu 時例外，因為即使這些殘基的 t-Bu 酯也會被 LiAlH4 還原。對於多肽，N-末端的氨基應該用 Boc 基團封閉；Fmoc 基團在這些條件下並不穩定。

  1. 使用前，將樹脂（0.1 mmole）在乾燥的 THF 中預先攪拌 1 小時，並置於裝有磁力攪拌器的圓底燒瓶中。
  2. 用氬氣沖洗圓底瓶，然後封口並置於冰浴中。
  3. 使用注射器在 THF 中加入 1 M LiAlH4（0.5 ml，0.5 mmolea）。輕輕攪拌 40 分鐘。
  4. 用 THF 稀釋混合物，並加入飽和 KHSO4 (0.5 ml) 和酒石酸 K, Na (0.3 ml)。
  5. 通過過濾除去樹脂，並用 DCM 洗滌。
  6. 用無水 MgSO4 將混和的有機濾液乾燥，並蒸發至乾。

a對於長肽，LiAlH4的用量可能需要增加；相反，對於小的有機分子，這個用量可能會大大減少。

方法 16：H-Thr-Gly-NovaSyn® TG 樹脂的裂解

樹脂的裂解和側鏈的脫保護分兩個階段進行。

  1. 用無水反式脂肪酸去除側鏈保護基團。
  2. 用 AcOH/water/DCM/MeOH (10:5:63:21) (3 x 30 min) 從樹脂中去除肽醛。

Novabiochem® 產品線目前提供預載 Arg、Asp、Leu、Phe 和 Val 醛的 H-Thr-Gly-NovaSyn® TG 樹脂。

裂解後的處理

在完成多肽分析前，請勿丟棄樹脂支持物或乙醚。兩者均可在氮氣或氬氣環境下保存於 4°C 以防止氧化。

乙醚沉澱

大多數裂解方案涉及使用冷乙醚沉澱粗裂解肽。以下是裂解後處理的一般程序。

方法 17：裂解後處理

肽的分離和處理可以通過沉澱 (1) 或離心 (2) 來實現。對於水溶性多肽，可使用步驟 3-6 中的方法。

  1. 沉澱：在輕度真空下，在赫氏漏斗中用硬化濾紙過濾沉澱的多肽。用冷乙醚進一步洗滌沉澱物，將肽溶解在適當的水性緩衝液中並凍乾。
  2. 離心：在殘餘物中加入小量的 t-丁基甲基醚，徹底輾碎，直到獲得自由懸浮液。將懸浮液轉移至乾淨的離心管中，密封並離心。此過程必須使用無火花離心機。小心傾倒管中的乙醚。必要時重複乙醚洗滌。將殘餘固體溶解於適當的水性緩衝液中，並凍乾。
  3. 水溶性多肽：沉澱後，向殘餘物中加水，並將混合物轉移到分離漏斗中。可能需要少許 AcOH 來幫助溶解。
  4. 充分搖動有塞漏斗。鬆開塞子，讓兩層液體靜置分離。
  5. 向漏斗中加入更多水，重複步驟 4 三次。移除上層（乙烷基）並儲存在乾淨的燒瓶中。
  6. 加入少量新的二乙醚，重複步驟 4 兩次或三次，每次除去乙醚層，將水層放回分離漏斗。

在上述方法中，如果在乙醚沉澱步驟之前先使用旋轉蒸發器（配備 CO2/ 丙酮冷指、油泵和酸捕捉器）去除反式脂肪酸，通常可以提高多肽的產率。在大多數情況下，加入乙醚後，多肽會附著在反應瓶的兩側，使清除劑能夠透過反覆的乙醚洗滌快速且容易地移除。注意：含有 TFMSA 和 HBF4 的裂解混合物不應蒸發至乾。

由於使用低-高 HF 裂解法製備的縮氨酸可能含有水溶性的鏻衍生物，建議在進行凍乾之前立即去除這些衍生物，因為在中性或微碱性條件下，它們可能會導致蛋氨酸和半胱氨酸殘基的烷基化。

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