脂質體製備 - Avanti^® 極性脂類

Dr. Stephen Burgess

Chief Scientific Officer at Avanti® Polar Lipids

1.囊泡形成機制

脂質體（脂質囊泡）是在薄脂膜或脂質餅水合時形成的，堆疊的液晶雙分子層會變得流動並膨脹。在攪拌過程中，水合的脂質薄片會脫落，並自我閉合，形成大型的多纖維膠囊 (LMV)，可防止水在邊緣與雙層的碳氫化合物核心互動。一旦這些微粒形成，要縮小微粒的尺寸，就需要以聲能 (聲化) 或機械能 (擠壓) 的形式輸入能量。

圖片來自 Lasic，D.D.，Recherche 20，904，1989

2.脂質體的制備方法

脂質配方的特性會因組成成分（陽離子、陰離子、中性脂質種類）的不同而有所差異，然而，無論組成成分如何，相同的制備方法可應用於所有脂質囊泡。程序的一般要素包括水合脂質的準備、攪拌水合，以及上漿至均勻分佈的囊泡。

A.水合脂質的製備

製備混合脂質成分的脂質體時，必須先將脂質溶解並混合在有機溶劑中，以確保脂質的均勻混合。通常使用氯仿或氯仿：甲醇混合物進行此過程。目的是獲得清澈的脂質溶液，以便完全混合脂質。脂質溶液通常以 10-20mg 脂質/毫升有機溶劑的濃度製備，但如果脂質溶解度和混合效果可以接受，也可以使用更高的濃度。當脂質在有機溶劑中徹底混合後，將溶劑移除以產生脂質膜。對於小容量的有機溶劑 (<1mL)，可在通風罩中使用乾燥的氮氣或氬氣流蒸發溶劑。對於較大容量的有機溶劑，應使用旋轉蒸發的方法去除，在圓底燒瓶的側面形成一層薄的脂質膜。將小瓶或圓底燒瓶放在真空泵上過夜，徹底乾燥脂膜以去除殘留的有機溶劑。如果不喜歡使用氯仿，也可以將脂質溶解在叔丁醇或環己烷中。將脂質溶液轉移到容器中，然後將容器放在乾冰塊上或在乾冰-丙酮或酒精（乙醇或甲醇）浴中攪拌容器進行冷凍。使用水浴程序時應注意，容器應能承受突然的溫度變化而不會破裂。完全冷凍後，將冷凍的脂質餅置於真空泵上，並凍乾至乾燥（視容量而定，需 1-3 天）。乾燥的脂質膜或脂質餅可從真空泵中取出，將容器蓋緊並貼上膠帶，冷凍保存，直到準備水合為止。

B.脂質膜/餅的水化

乾脂質膜/餅的水化只需將水性介質加入乾脂質容器中並攪拌即可完成。在加入乾脂質之前，水合介質的溫度應高於Tc最高的脂質的凝膠-液體結晶轉換溫度（Tc或Tm）。加入水合介質後，脂質懸浮液在水合期間應保持在 Tc 以上。對於高轉換脂質，只要將脂質懸浮液移至圓底燒瓶中，並將燒瓶放置於不抽真空的旋轉蒸發系統中，即可輕鬆達成此目的。在溫水浴中旋轉圓底燒瓶，溫度保持在脂質懸浮液的 Tc 以上，使脂質在充分攪動下在其液相中水合。不同種類和結構的脂質水合時間可能略有不同，但強烈建議在劇烈搖晃、混合或攪拌下水合時間為 1 小時。我們也相信，在縮小之前讓囊泡懸浮液靜置過夜（老化）可使縮小過程更容易，並改善大小分佈的均勻性。不建議對高轉換脂質進行老化，因為脂質水解作用會隨著溫度升高而增加。

水合介質通常由脂質囊泡的應用來決定。適合的水合媒介包括蒸餾水、緩衝溶液、生理鹽水和非電解質，例如糖溶液。建議使用生理滲透率 (290 mOsm/kg) 作為體內應用。一般符合這些條件的溶液有 0.9% 生理鹽水、5% 葡萄糖和 10% 蔗糖。在水化過程中，有些脂質會因其結構而形成複合物。據觀察，高電荷的脂質在與低離子強度溶液水合時會形成黏稠的凝膠。縮略圖 這個問題可以透過添加鹽分或縮小脂質懸浮液的大小來緩解。水合性差的脂質 (例如磷脂酰乙醇胺) 在水合時有自我聚合的傾向。磷脂酰乙醇胺含量超過 60 mol% 的脂質囊泡會形成顆粒，在囊泡周圍有一小層水合層。當顆粒彼此接近時，沒有水合斥力排斥接近的顆粒，兩層膜會掉入能量井中，在那裡它們會黏住並形成聚集體。聚集體會以大型絮狀物的形式從溶液中沉降出來，這些絮狀物會在攪拌時分散，但靜置後又會重新形成。水化的產物是一個大型的多層纖維囊泡 (LMV)，結構類似洋蔥，每個脂質雙層被水層隔開。脂質層之間的間距由成分決定，多水合層比高電荷層靠得更近，而高電荷層則根據靜電排斥力分開。一旦製造出穩定的水合 LMV 懸浮液，就可以使用各種技術（包括聲納處理或擠壓）來縮小顆粒。

C.脂質懸浮液的大小

i.聲波處理

使用聲波能量（聲波處理）破壞 LMV 懸浮液，通常會產生直徑在 15-50nm 範圍內的單琺瑯質小泡 (SUV)。製備超音波顆粒最常見的儀器是浴槽和探針尖超音波器。杯角式聲波儀雖然使用較少，但也成功製備出 SUV。探針式聲波儀可向脂質懸浮液提供高能量輸入，但會因脂質懸浮液過熱而造成降解。聲波探頭也容易將鈦微粒釋放到脂質懸浮液中，使用前必須先將其離心移除。基於這些原因，水浴式音波儀是製備 SUV 最廣泛使用的儀器。LMV 分散液的聲波處理方法是將含有懸浮液的試管放入水浴式聲波儀（或將聲波儀的頂端放入試管中），然後在高於脂質 Tc 的情況下進行 5-10 分鐘的聲波處理。脂質懸浮液應開始澄清，形成略微混濁的透明溶液。霧度是由懸浮液中殘留的大顆粒引起的光散射所致。這些顆粒可藉由離心除去，得到透明的 SUV 懸浮液。平均粒徑與分佈會受到成分與濃度、溫度、音波處理時間與功率、體積以及音波器調整等因素的影響。由於幾乎不可能重現音波處理的條件，因此不同時間生產的批次之間的尺寸差異並不罕見。此外，由於這些膜的曲率很高，SUV 本身就不穩定，當儲存溫度低於其相變溫度時，會自發融合形成更大的囊泡。

如需更多關於聲波處理的資訊， read "Morrissey Lab Protocol for Preparing Phospholipid Vesicles (SUV) by Sonication."

ii.擠壓

脂質擠壓是一種技術，在這種技術中，脂質懸浮液被強制通過具有確定孔徑的聚碳酸酯過濾器，以產生直徑接近所用過濾器孔徑的微粒。在通過最終孔徑擠壓之前，LMV 懸浮液會經過幾次冷凍-解凍循環或通過較大孔徑（通常為 0.2µm-1.0µm）的預過濾而被破壞。此方法有助於防止膜堵塞，並改善最終懸浮液粒度分佈的均勻性。與所有縮小 LMV 分散液的程序一樣，擠壓應在高於脂質 Tc 的溫度下進行。嘗試在 Tc 以下擠出是不成功的，因為膜會與無法通過孔隙的硬膜發生摩擦。通過 100nm 孔隙的過濾器擠壓通常會產生平均直徑為 120-140nm 的大型單嗜鈉囊泡 (LUV)。平均粒徑也取決於脂質成分，不同批次的重複性相當高。