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首頁原代細胞培養技術多能人間充質幹細胞(MSCs)向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的三系分化

多能人間充質幹細胞(MSCs)向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的三系分化

間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是纖維母質型多能成體幹細胞,具有很高的自我更新和分化能力。這些細胞已從多種人體組織中分離出,包括骨髓、脂肪組織、臍帶基質、肌腱、肺和骨膜。1 最近有研究顯示,間充質幹細胞起源於血管周圍龕,這是一個遍布全身血管的緊密網絡。這些血管周圍細胞缺乏血管內皮和造血標誌物,例如 CD31、CD34 和 CD45,但能表達 CD146、PDGFR beta 和鹼性磷酸酶。2 根據國際細胞治療協會(ISCT)發表的立場書,間充質干細胞表達表面標誌物CD73、CD90和CD105,CD14或CD11b、CD34、CD45、CD79α或CD19和HLADR染色陰性。3 除了表面標記分析之外,鑑定間充質干細胞族群最常見、最可靠的方法是驗證它們的多能性。間充質干細胞可以分化成脂肪細胞、成骨細胞、肌細胞和軟骨細胞 體內 和 體外。1,4 當應用特定的培養條件和刺激時,在體外也觀察到間葉細胞轉分化為非間葉細胞來源的細胞,例如肝細胞、神經元和胰島細胞。1 間充質干細胞的定向分化是在體外使用適當的分化培養基進行的,例如即用型 PromoCell 間充質干細胞分化培養基(1 PromoCell MSC Differentiation Media)。a href="/product/sigma/C28016" target="_blank">C-28016, C-28012C-28014C-28013C-28015). 

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圖解說明血管周圍祖細胞分化為各種細胞類型,包括肌細胞、脂肪細胞、成骨细胞、神經元和軟骨細胞,並列出細胞標記,如 CD146+、PDGFRβ+ 和鹼性磷酸酶+。

圖 1.人類間充質干細胞的體外分化。在適當的培養條件下,多能人類間充質幹細胞可分化為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞和神經元。

成骨分化協議

  1. 塗上培養容器。 在 6 孔組織培養板上塗上 10 μg/mL 人類纖維連接素 或 牛類纖維連接素 ,按照說明書進行。
  2. 種植間充質幹細胞。 Plate MSCs at 1x105 cells per well in the fibronectin coated tissue culture plate using MSC Growth Medium 2 (C-28009)。一式兩份。
  3. 讓間充質幹細胞生長. 讓細胞達到 80-90% 匯合。這需要 24-48 小時。
  4. 誘導間葉幹細胞.用間葉細胞成骨分化培養基(C-28013)誘導其中一個複製樣本。
  5. 誘導間充質幹細胞. 培養 12-14 天。每三天更換一次培養基。小心不要打亂細胞單層。
  6. 清洗細胞. 分化步驟完成後,將細胞從培養箱中取出,小心吸出培養基。用不含 Ca++/Mg++ (D8537)的 Dulbecco 磷酸緩衝生理鹽水 (PBS) 輕輕地清洗細胞。小心吸出 PBS 並加入足夠的 Saccomanno 固定液以覆蓋細胞單層。至少 30 分鐘後,輕輕吸出固定液,用蒸餾水洗淨細胞。使用前,立即將所需數量的茜素紅 S 染色液(TMS008)通過 0.22 μm Millex PES 過濾器。小心吸出蒸餾水,並加入足夠的過濾茜素紅 S 染色液以覆蓋細胞單層。室溫暗處培養 10-15 分鐘。
  7. 清洗細胞. 小心吸出茜素紅 S 染色液,用 1 mL 蒸餾水洗細胞單層四次。小心吸出蒸餾水,並加入 PBS。
  8. 分析細胞 立即分析樣本,因為染料可能會在長時間儲存而未包埋的情況下出血。未分化的間充質干細胞(無細胞外鈣沉積)呈無色/微紫色,而間充質干細胞衍生的成骨細胞(有細胞外鈣沉積)染成明亮的橙紅色(圖 1)。
MSC 陰性對照(上圖)在 PromoCell MSC Growth Medium 2 培養 12 天,分化樣本(下圖)則在 MSC Osteogenic Differentiation Medium 培養 12 天。與陰性對照不同的是,由間葉細胞分化出來的成熟成骨細胞呈現強烈的橘紅色礦化骨基質染色。也請注意在一些較大的骨結節中,茜素紅 S 染色的濃度。

圖 2.礦化hMSCBM衍生的成熟成骨細胞中細胞外鈣沉積的茜素紅S染色。陰性對照(上圖)用PromoCell MSC Growth Medium 2培養MSC細胞12天,分化樣本(下圖)用MSC Osteogenic Differentiation Medium培養MSC細胞12天。與陰性對照不同的是,由間葉細胞分化出來的成熟成骨細胞呈現強烈的橘紅色礦化骨基質染色。也請注意在一些較大的骨結節中,茜素紅 S 染色的濃度。

Adipogenesis Differentiation Protocol

  1. 塗上培養容器。 在6孔組織培養板上塗上10 μg/mL人纖維連接素 或 牛纖維連接素 ,按照說明書進行。
  2. 種植間充質幹細胞。 在塗有纖維連接素的 6 孔組織培養板中,使用 MSC Growth Medium 2 (C-28009),每孔培養 1 x 105 MSC。
  3. 讓間充質幹細胞生長. 讓細胞達到 80-90% 匯合。這需要 24-48 小時。
  4. 誘導間葉幹細胞. Induce one of the duplicate samples with MSC Adipogenic Differentiation Medium 2 (C-28016)。
  5. 誘導間充質幹細胞的分化. 培養 12-14 天。
  6. 清洗細胞. 分化步驟完成後,將細胞從培養箱中取出,小心吸出培養基。用不含Ca++/Mg++ (D8537)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻清洗细胞。
  7. 固定細胞. 小心吸出 PBS (D8537),並加入足夠的 Saccomanno 固定液以覆蓋細胞單層。在室溫下培養至少 30 分鐘。
  8. 清洗細胞. 小心吸出固定緩衝液,用蒸餾水清洗細胞單層。輕輕吸出水並加入足夠的 60% isopropanol to cover the cell monolayer.室溫孵育 5 分鐘。
  9. 染色細胞。小心吸出 60% 異丙醇,加入足夠的 OilRedO 染色液 (O1391)以覆蓋細胞單層。室溫孵育 10-15 分鐘。
  10. 清洗細胞. 小心吸出染色液,用蒸餾水洗細胞單層數次,直到水變清。
  11. Analyze the cells. Cover with PBS and analyze the stained samples promptly as the dye tends to fade upon prolonged light exposure.成熟脂肪細胞的細胞內脂質囊泡會被染成鮮紅色。
hMSC-BM 衍生脂肪細胞中脂滴的油紅 O 染色。

圖 3.hMSC-BM 衍生脂肪細胞中脂滴的油紅 O 染色。使用 PromoCell MSC 成脂肪分化培養基 2 從 hMSC-BM(源自骨髓的人類間充質干細胞)分化出的脂肪細胞中的脂質空泡積聚。分化後的培養物呈現成熟脂肪細胞典型的廣泛細胞內脂質空泡形成(左:40 倍放大;右:100 倍放大)。

Chondrogenesis Differentiation Protocol

  1. 陰性對照培養基的準備。陰性對照培養基為 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, low glucose) with 2 mM L-glutamine and 10% fetal bovine serum.
  2. 種植間充質幹細胞。使用陰性對照培養基,在 96 孔 Ubottom 懸浮培養板中以每孔 2 x 105 cells 的數量培養間充質幹細胞。
  3. 間充質干細胞球體形成. 球體將在培養 24-48 小時內自發形成。 Induce one of the duplicate samples with MSC Chondrogenic Differentiation Medium (C-28012)。
  4. 分化誘導間充質干細胞球體. 培養 21 天。
  5. 清洗軟骨球. 分化步驟完成後,將細胞從培養箱中取出,小心地吸出培養基。用不含Ca++/Mg++ (D8537)的Dulbecco磷酸緩衝生理鹽水(PBS)輕輕地清洗球體。
  6. 固定軟骨球. 小心吸出 PBS。加入足夠的 Saccomanno 固定液以覆蓋軟骨球。在室溫下培養 3 小時。
  7. 清洗軟骨球體。 小心吸出固定液,用蒸餾水洗球體兩次。
  8. 保存細胞。 使用前,立即將所需數量的 Alcian Blue 染色液 (TMS010)通過 0.22 μm Millex PES 過濾器。小心吸出蒸餾水,並加入足夠的過濾 Alcian Blue 染色液,以充分覆蓋軟骨球體,因為會有一些蒸發。在室溫下暗處培養 45 分鐘。
  9. 清洗細胞. 小心吸出阿爾仙藍染色液,用去漬液清洗軟骨球體 10 分鐘。重複清洗步驟兩次。小心吸出去漬液,加入 PBS。
  10. 分析軟骨球. 軟骨將被染成強烈的深藍色,而其他組織最多被染成淺藍色。
hMSC-BM 衍生軟骨細胞的 Alcian Blue 染色

圖 4.hMSC-BM 衍生軟骨細胞的 Alcian Blue 染色。使用 PromoCell MSC Chondrogenic Differentiation Medium 體外分化為軟骨後的間充質干細胞球體。在陰性對照培養基中培養的球體染成淺藍色(上排)。相比之下,誘導培養的球體呈現濃烈的藍色,顯示軟骨細胞外基質(下行)。

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參考資料

1.
da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. 2008. In Search of the In Vivo Identity of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells. 26(9):2287-2299. https://doi.org/10.1634/stemcells.2007-1122
2.
Crisan M, Yap S, Casteilla L, Chen C, Corselli M, Park TS, Andriolo G, Sun B, Zheng B, Zhang L, et al. 2008. A Perivascular Origin for Mesenchymal Stem Cells in Multiple Human Organs. Cell Stem Cell. 3(3):301-313. https://doi.org/10.1016/j.stem.2008.07.003
3.
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop D, Horwitz E. 2006. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8(4):315-317. https://doi.org/10.1080/14653240600855905
4.
Caplan A. 2008. Cell Stem Cell. 3(3):229-30
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