內皮細胞跨孔遷移及入侵試驗

血管生成是一個受到嚴格調控的細胞事件，由促血管生成信號和抗血管生成信號平衡，這些信號包括整合素、化學因子、血管生成素、氧感應劑、結合分子和內源性抑制劑。⁴ 雖然生理性血管生成是高度組織化的，但病理性血管生成的控制較差，血管很少會因應疾病而成熟、重塑或退行。⁵ 由於內皮細胞的遷移和入侵對血管生成至關重要，所謂的 transwell cell migration and invasion assays are helpful tools for studying the underlying mechanisms of angiogenic events.細胞遷移可簡單定義為細胞在外在生化訊號的引導下，從一個位置移動到另一個位置的過程。另一方面，細胞入侵則是量測血管內皮細胞在三維基質（如基底膜）中移動的能力。這是一個複雜的多步驟過程，包括黏附、ECM 成分的蛋白水解、微環境的重組以及穿過基質的移動。⁶

 in vitro transmigration assay，又稱為 Boyden 室實驗，用於測量內皮細胞沿細胞活素梯度的遷移（趨化），以及測量測試物質在體外的趨化能力 。它包括兩個由微孔膜分隔的充滿培養基的隔間。通常，細胞會被放置在上層隔間中，並透過膜的微孔移動到下層隔間中，而下層隔間中則有化學引導劑存在。經過適當的孵育時間後，固定兩個隔間之間的膜，並測定遷移至下側的細胞數量。

 體外 侵襲試驗 測量內皮層細胞穿過細胞外基質的細胞遷移。⁹ 與 transwell 遷移實驗一樣，細胞侵襲實驗涉及兩個隔間，隔間由具有精確定義孔徑的膜分隔。該膜由模仿血管基底膜的基質覆蓋。將潛在的化學引導因子放置在其中一間隔中，並在膜上形成梯度。導入另一隔室的內皮細胞會降解基質，然後沿著這個梯度移動。經過適當的孵育時間後，將膜固定並染色，就可以數出遷移過膜的細胞。

圖 1. 內皮細胞轉移和侵襲試驗的工作流程。

Endothelial Cell Transwell Migration and Invasion Assay Protocols

Transmigration Assay Protocol

1. 製備內皮細胞培養液。使用推薦的內皮生長培養基，將 5X10³ cells/cm²  （或各產品手冊中的推薦值）的 PromoCell 內皮細胞平板於合適的培養容器中。每 2-3 天更換一次培養基。讓細胞達到 70-90% 匯合度。
2. 準備測試培養基。在內皮細胞基礎培養基中加入10% FBS 製備適量的檢測培養基（例如9 mL基礎培養基+1 mL FBS）。
3. 將培養基和試劑調至室溫。 Pre-warm the assay medium and the components of the PromoCell DetachKit at room temperature for 1-2 hours.
4. Prepare the test medium. Dissolve the test substance in assay medium.24 孔板的每孔應使用 750 μL 測試培養基。我們建議多準備一種含有 20 ng/mL VEGF or bFGF to be used as a positive control.
5. 準備 24 孔板，加入測試培養基. 將細胞培養插片放入 24 孔板的孔中。在每個孔的外格中加入 750 μL 測試培養基。
6. 取下內皮細胞。內皮細胞應匯合 70-90%。從培養容器中移除培養基，加入 200 μL/cm² PBS (D8537)清洗細胞。移除 PBS 並加入 100 μL/cm² Trypsin/EDTA (T3924)。關閉容器，在顯微鏡下檢查細胞。當細胞開始脫落時，輕輕敲打容器側面以鬆開剩餘的細胞。加入 100 μL/cm² Trypsin Neutralization Solution (T6414)中和胰蛋白酶溶液，輕輕搖動培養容器 30 秒。
7. 計數細胞. 將細胞懸浮液轉入離心管中，在室溫下以 220 x g 離心 4 分鐘。除去上清液，將細胞顆粒重懸於 5 mL 分析培養基。8. Seed the cells in the cell culture inserts.用分析培養基稀釋細胞濃度至1x 10⁵ 細胞/mL。小心地將 500 μL 的細胞懸液 (= 5X10⁴ cells) 加入 24 孔板的細胞培養插板中。在加濕培養箱（37 °C，5% CO₂）中培養 24 孔板插板中的細胞 3-6 小時。在孵育期間，膜上會形成測試物質的梯度。
10. 移除膜上層未移動的細胞. 小心移除所有細胞培養插片中的培養基。然後，使用鑷子取出插入物，吸出每個孔中的培養基。將插入物放回孔中後，用棉花棒移除膜上側的非移行細胞。
11. 進行移行細胞的固定和染色。

侵襲分析協議

1. 準備內皮細胞培養。使用推薦的內皮生長培養基，以 5X10³ cells/cm² Plate PromoCell Endothelial Cells 於適當的培養容器中。每 2-3 天更換一次培養基。讓細胞達到 70-90% 匯合度。
2. 準備侵襲檢測室，並將培養基和試劑調整到適當的溫度. 準備適量的檢測培養基，在內皮細胞基礎培養基中加入 10% FBS (例如 9 mL 基礎培養基 + 1 mL FBS)。在每個孔中加入 750 μL 分析培養基，在細胞培養插板中加入 500 μL Matrigel/ECM Gel 。將 24 孔板置於加濕培養箱 (37 °C, 5% CO₂) 中 1-2 小時。
3. 準備測試培養基. 將測試物溶於測試培養基。24 孔板的每孔應使用 750 μL 測試培養基。我們建議多準備一種含 20 ng/mL VEGF or bFGF to be used as a positive control.
4. 向孔中加入測試培養基. 用鑷子從 24 孔板的孔中取出塗有 Matrigel/ECM Gel  的插入物，從每個孔中吸出測試培養基。5. Detach endothelial cells. Endothelial cells should be 70-90% confluent.從培養容器中移除培養基，加入 200 μL/cm² PBS (D8537)清洗細胞。移除 PBS 並加入 100 μL/cm² Trypsin/EDTA (T3924)。關閉容器，在顯微鏡下檢查細胞。當細胞開始脫落時，輕輕敲打容器側面以鬆開剩餘的細胞。加入 100 μL/cm² Trypsin Neutralization Solution (T6414)，中和胰蛋白酶溶液，轻轻摇晃培养皿 30 秒。
6. 計數細胞. 將細胞懸液轉入離心管中，室溫下以 220 x g 離心 4 分鐘。除去上清液，將細胞顆粒重懸於 5 mL 分析培養基。按照您的標準程序測定細胞數。
7. 將細胞播種於塗有 Matrigel/ECM Gel 的細胞培養插管中。用分析培養基稀釋細胞濃度至1x10⁵ 細胞/mL。從 Matrigel 塗層插入物中移除檢測培養基，但不接觸 Matrigel 塗層表面。小心地將 500 μL 的細胞懸液 (= 5X10⁴ cells) 加入細胞培養插片中。
8. 開始侵襲實驗。 在加濕恆溫箱（37 °C，5% CO₂）中培養Matrigel塗層插入物中的細胞16-28小時。在培養期間，膜上會形成測試物質的梯度。
9. 移除膜上層未移動的細胞. 小心移除所有 Matrigel/ECM Gel 塗層插入物上的培養基。然後，使用鑷子移除插入物，並吸出每個孔中的培養基。將插入物放回孔中後，用棉花棒移除膜上端的非移行細胞。
10. 進行移行細胞的固定和染色。

分析移行的細胞

細胞固定和染色
1. 固定膜和乾燥插片. 小心移除孔中的 PBS，向孔中加入 750 μL 冷甲醇（34860）（4 °C）。在室溫下培養 20 分鐘。小心移除甲醇並等待 30 分鐘。在此期間，膜會風乾。乾燥後，膜可儲存於 4 °C，稍後再處理。
2. 染色細胞。 在孔中加入 750 μL 水晶紫（V5265），室溫孵育 20 分鐘。 Wash the membrane. Carefully remove the staining solution and wash three times thoroughly with distilled water.
4. Proceed with analysis.

分析

1. Visual quantification.在 24 孔板的孔中注入 750 μL 蒸餾水，使用倒置顯微鏡計數膜下部移動的細胞。
2. 使用微孔板閱讀儀進行色度定量。在孔中注入 750 μL 10%乙酸（A6283），孵育 30 秒，同時小心搖動 24 孔板。膜上的細胞會被醋酸裂解，細胞中的水晶紫會釋放出來。從 24 孔板中取出插入物，使用微孔閱讀器在 595 nm 處讀取 10% 醋酸的光密度。

圖 2. 內皮細胞在 VEGF 刺激下的體外細胞移動。在不含 VEGF 的情況下（左）和在介質中含有 20 ng/ml VEGF 的情況下（右），已遷移通過膜的細胞。細胞以水晶紫染色。

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