在 Millicell^® 微孔板上進行有機體生成和表型篩選

在生物醫學研究應用中，有機體是一種越來越常用的工具，它是可以在體外重現器官的三維微型模型。

傳統的有機體是在固化的細胞外基質 (ECM) 中培養，通常無法重現。所形成的有機體可能具有不同的大小和形狀，並且可能隨機放置在水凝膠內的多個位置和病灶平面上。Millicell^® Microwell 96 孔板可標準化並克服傳統有機體培養中的一些挑戰。

• Millicell^® 微孔板上小鼠腸有機體的發展和特性
• Afuresertib對CRC有機體的深入分析
• CRC有機體表型篩選摘要

圖 1. 傳統類器官培養 (左) vs Millicell^® Microwell 96 孔板中類器官培養 (右)。

Millicell^® Microwell 96 孔板特性

Millicell^®Microwell板是一種即用型平台，可用於高通量、可擴展且可靠的類器官培養。這些平板的孔內含有非黏附性微細胞，可增加均勻的類器官產量。Millicell^® 微孔板幾乎不需要外部固體 ECM，每個微孔都含有獨特的水基聚乙二醇 (PEG) 水凝膠。PEG 水凝胶允许孔内细胞播种和检测开发，并减少板内成像时的衍射。

圖 2. 體外三維類器官篩選方法示意圖。從左至右依次為 Matrigel^®、非黏附表面和 Millicell^® Microwell 板。

我們針對不同微孔尺寸的標準設計，可讓您使用 Millicell^® Microwell 96 孔板按比例製造類器官。

* 表示每孔可能的最大微孔數。每孔的精確數目可能略有不同，可能相差 7%。

微孔尺寸 (μm)	微孔數量/孔	工作容積 (l)	底部	產品編號
400μm	121*	200	塑膠	MC96U4005
600μm	55*<	200	塑膠	MC96U6005

圖 3. 各微孔尺寸的微孔/孔示意圖。

Millicell^® Microwell 板上的小鼠腸道有機體開發和表徵

作為最早被描述的有機體之一，小鼠腸道有機體是研究癌症治療、免疫學和微生物組學的研究人員常用的模型。 我們使用 Millicell^® Microwell 400μm 96 孔板來培養和表徵小鼠腸道有機體。

有機體在整個播種、生長和成像過程中都受到監控；在一個孔中隨著時間的推移培養出 121 個單一有機體。這些有機體的大小均勻，並被限制在微孔中，有助於成像。小鼠腸有機體在分化後呈現典型的出芽形態，分化後的腸細胞表達特定的腸標誌物。

圖 4. 在 Millicell® Microwell 板上生長的小鼠腸有機體。A) 1 小時後，B) 10 小時後，C) 2 小時後，D) 3 天後，及 E) 4 天後。3 天，以及 E) 播種後 4 天。

透過在 Millicell^® Microwell 96 孔板中隨時間變化的成像來量化有機體的面積。有機體被限制在特定的微腔中，在生長的最初 1-3 天大小均勻，然後隨著有機體開始出芽而擴大。

圖 5. 在 Millicell^® Microwell 板上生長的小鼠腸有機體的代表性示例，天數為 A)3; B)5; 和 C)8.

這些有機體呈現出芽表型，是這些腸有機體的典型表型，並含有分化的細胞，包括腸內分泌細胞、腸細胞、Paneth細胞和絨毛細胞。在玻璃成像玻片上通過免疫螢光 監測特定標記和上皮極性（圖 6）。

圖 6. 黏蛋白-2 的蛋白質表達突顯了在微細孔實驗中生長的器官組織中存在著胃小管細胞。

使用 Millicell^® Microwell 板產生的有機體是可擴展的，並產生大小和形狀相似的有機體。

Millicell^® Microwell 板上的 CRC Organoid 表型篩選

我們使用 Millicell^® Microwell 96 孔板對 HCT-116 球形體和源自患者的結腸直腸癌 (CRC) 器官組織進行了 80 種抗癌化合物的自動藥物篩選。

在分析Millicell^® Microwell 96孔板上生長的有機體的表型時，發現了一種之前未曾觀察到的表型。在此，我們證明 Millicell^® Microwell 96 孔板可用於全自動、高通量篩選，在單一有機體層級評估藥物和其他化合物的影響。

圖 6. CRC organoids 藥物篩選工作流程，A)在 Millicell^® Microwell 96 孔板上對 CRC 器樣細胞和 HCT-116 球形細胞進行化合物篩選的規程，B)自動化（水凝膠平衡、細胞接種、培養基更換與藥物曝露及分析）與手動（類器官解離）產生類器官的示意圖，C)量化手動與自動類器官生成過程中含有菌落的孔的百分比。

化合物暴露後，評估有機體的存活能力，並透過高含量成像分析監測其表型。從每孔分割的 40 個有機體中，每個都萃取了 250 多個指標，並透過陽性和陰性對照確定藥物的療效。篩選結果顯示重現性很高，球體的 R² 值為 0.9，而有機體的 R² 值為 0.79。

深入分析afuresertib對CRC organoids的影響

Afuresertib是一種血清/蘇氨酸蛋白激酶Akt（蛋白激酶B）的抑制劑。它可以通過抑制 Akt 來抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡。分析本研究使用的 80 種化合物顯示，暴露於 afuresertib 會在次毒性濃度下導致強烈的表型，包括 CRC organoids 上的主要腫脹，而非 HCT-116 spheroids 上的腫脹。這種表型在傳統的存活率分析中並不常被監測到，但使用Millicell^® Microwell 96孔板卻很容易看到。

圖 7. 阿福瑞替(afuresertib)的CRC類器官篩選，A)寬視野和螢光圖片顯示不同濃度afuresertib的類器官大小，B)按微組織區分的有機體表型對濃度增加的 afuresertib 的反應 IC50=0.31μM, C)在增加 afuresertib 濃度 IC50=10.67μM 時，類器官的存活率。甘草酸：GA.

CRC有機體表型篩選摘要

在Millicell^® Microwell板中製作CRC有機體和HCT-116球形體，從播種到成像讀數，都與自動液體處理系統和高通量篩選應用相容。Millicell^® Microwell 細胞板也允許進行單一器官分析，而非基於族群的讀數，即使每孔可產生超過 70 個器官。

研究人員發現，在 Millicell^® Microwell 試劑板中產生的病患衍生器官組織與相對應的腫瘤模型非常接近，研究人員可用來研究病患對化療的特定反應。

參考資料

1. Lancaster MA, Knoblich JA. 2014. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345(6194): https://doi.org/10.1126/science.1247125

2. Fatehullah A, Tan SH, Barker N. 2016. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18(3):246-254. https://doi.org/10.1038/ncb3312

3. Schneeberger K, Spee B, Costa P, Sachs N, Clevers H, Malda J. Converging biofabrication and organoid technologies: the next frontier in hepatic and intestinal tissue engineering?. Biofabrication. 9(1):013001. https://doi.org/10.1088/1758-5090/aa6121

4. Sato T, Stange DE, Ferrante M, Vries RG, van Es JH, van den Brink S, van Houdt WJ, Pronk A, van Gorp J, Siersema PD, et al. 2011. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141(5):1762-1772. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.07.050