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多重肌動蛋白分析：同時測量多種肌肉泌出因子

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    肌動素系統多樣性，參與各種訊號傳導通路。多重肌動因子免疫分析法，例如 MILLIPLEX® 人類肌動因子檢測板，可讓研究人員同時測量多種肌肉分泌因子，提供更多相關疾病的洞察力。

    什麼是肌動因子？

    骨骼肌積極參與許多蛋白質的合成和分泌，這些蛋白質統稱為肌動因子。1肌動素能以自分泌和/或旁分泌的方式調節骨骼肌的新陳代謝、肌肉增殖和肌肉分化（肌肉生長），如圖 1 所示。

    肌動素訊號傳導通路示意圖。由骨骼肌分泌的肌動素會傳送訊號至不同的器官，包括肝臟、胰臟、骨骼和循環系統。血管生成上調的確切機制仍在研究中。改編自 Pedersen BK, Febbraio MA.肌肉、運動與肥胖：作為分泌器官的骨骼肌。Nat Rev Endocrinol.2012 Apr 3; 8(8)：457 - 65.

    圖 1. 骨骼肌分泌的肌動素會向多種器官發出信號，包括肝臟、胰臟、骨骼和循環系統。血管生成上調的確切機制仍在研究中。改編自 Pedersen BK, Febbraio MA.肌肉、運動與肥胖：作為分泌器官的骨骼肌。Nat Rev Endocrinol.2012 Apr 3; 8(8)：457 - 65. 1

    肌動素還可以作為內分泌激素改變細胞代謝、內皮功能和腫瘤生長/延緩。這些肌動因子也參與各種組織的發炎反應，包括心臟、脂肪組織、乳房、結腸、肝臟、腸道、內皮、骨骼和骨骼肌。新興的證據支持運動的抗發炎、對抗疾病效果可能是由這些肌動因子所介導，而且肌動因子信號傳導通路與先天性免疫、神經信號傳導和胰島素反應相互交叉。2,3

    此外，骨骼肌功能和質量的進行性損失，即肌肉疏鬆症，是衰老或老化的一個嚴重特徵，也是老年綜合症（包括功能衰退和譫妄）的一個關鍵組成部分。越來越多的證據顯示，肌肉衍生的生長因子和細胞因（又稱肌動素）會調節與年齡相關疾病的進程，並有助於組織間的溝通，而這種溝通正是全身性老化的基礎。

    肌動因子多重分析

    在臨床前和轉譯研究模型中，量化肌動因子的需求日益增加，因此在這項研究中需要多重免疫分析。肌動因子的多重分析可讓研究人員同時測量多種肌動因子。舉例來說，MILLIPLEX®人類肌動因子檢測組是一個 15 複合試劑盒，可同時定量檢測血清或血漿樣本中下列任何或所有分析物，這些分析物具有表 1.

     

    中所述的生物功能。
    功能
    APLN凋亡素凋亡素的功能取決於它所表達的組織。Apelin 在血管組織中可調節血壓，在心臟組織中可調節心臟收縮，在大腦中可調節食物和水的攝取，在消化道中可調節葡萄糖的吸收和胰島素的抑制。
    BDNF腦源性神經營養因子與長期記憶有關，BDNF 的分泌會隨著運動而增加。
    EPO紅細胞生成素由於它可以刺激紅血球的製造，因此運動員可以使用它來增加身體的供氧量，表面上看來可以改善運動表現。
    FABP3脂肪酸結合蛋白 3此肌動素由心肌組織產生，並調節心臟對長鏈脂肪酸的吸收。它是心肌梗塞和急性冠狀動脈事件的可靠早期生物標記。
    FGF-21成纖維母細胞生長因子 21FGF-21由Akt活化，是一種新陳代謝調節激素和肌動素。
    N/AIrisin纖維連結素 III 型結構域含蛋白 5 (FNDC5) 的裂解和分泌部分 - 一項使用串聯質譜法進行的蛋白質組學研究，曾一度引起爭議的虹膜蛋白功能現在有了定論。4虹膜素的含量會隨著運動而增加，可能會介導白色脂肪的褐變。
    FSTL1軟骨素相關蛋白 1受一氧化氮信號調節，FSTL1 能誘導肌肉中新生血管的生長，並保護心肌細胞免於缺血誘發的細胞凋亡。
    CX3CL分叉蛋白CX3CL1是一種在單核細胞、自然殺傷細胞、T細胞和平滑肌細胞上表達的趨化因子蛋白。它最近與肥胖、胰島素抵抗和 2 型糖尿病有關。
    IL-6白細胞介素 6IL-6在某種程度上是一種"它能調節多種不同的運動反應過程，包括葡萄糖產生、脂肪氧化和脂肪分解。
    IL-15白介素 15IL-15調節T和NK細胞的活化和增殖。
    LIF白血病抑制因子此蛋白可抑制分化，並可能在運動時活化心臟和肌肉幹細胞。
    GDF8生長分化因子 8 (肌抑素)在回饋迴圈中，肌抑素抑制肌肉細胞的生長，並阻礙幹細胞向肌肉系分化。
    OSM營養素 M營養素 M 屬於 IL-6 細胞激素家族，可能與 IL-6 有相同的功能，尤其是在調節發炎方面。
    OSTN骨化素（Musclin）musclin的主要作用是調節葡萄糖新陳代謝。
    SPARC酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白 (Osteonectin)SPARC是一種肌動蛋白，可在運動時，藉由誘導細胞凋亡，阻斷大腸中腫瘤的發展。

    表 1.MILLIPLEX®人類肌動蛋白面板中的分析物質及其生物功能。

    方法

    使用檢測試劑盒中包含的標準品及血清和血漿樣品進行多重檢測，並使用MILLIPLEX®人肌動蛋白磁珠分析板，按照隨附方案中的說明進行。捕獲抗體包被的磁珠與樣品孵育以固定分析物。加入生物素化的檢測抗體。此檢測抗體與被分析物質結合形成夾心層。加入 Streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) 染料，使其與夾層結合並發出螢光。

    多重結果

    使用在血清基質中系列稀釋的各分析物標準，製備標準曲線以確定檢測反應（相對於分析物濃度的平均螢光強度 [MFI]）。標準曲線確定了檢測對所有被分析物產生了超過 3 到 5 個數量級的線性 MFI 反應（圖 2）。

    圖表顯示 MILLIPLEX® 人類肌動蛋白檢測組的標準曲線。使用在經驗證的血清基質中系列稀釋的各分析物標準，製備標準曲線以確定與分析物濃度相關的檢測反應。標準曲線確立了所有分析物在三到四個數量級上的線性。分析物的濃度以 MFI 量測。

    圖 2. 使用在經驗證的血清基質中系列稀釋的各分析物標準，製備標準曲線以確定分析物濃度的分析反應。標準曲線確立了所有分析物在三到四個數量級上的分析線性。分析物的濃度以 MFI 量測。

     

    交叉反應性

    在面板中未見明顯的交叉反應。除了Fractalkine、LIF和IL-6外，本人類肌動蛋白小組中的大部分抗體都能識別猴子樣本。發現以下交叉反應：

    • Apelin與小鼠、狗、兔子和迷你豬有交叉反應。
    • BDNF與小鼠和兔子有交叉反應。
    • EPO與狗和兔子有交叉反應。
    • IL-15 與馬有交叉反應。
    • Myostatin 與狗、迷你豬及馬有交叉反應。
    • FABP3 與大鼠、兔子、迷你豬及馬有交叉反應。
    • FSTL1 與小鼠、兔子、迷你豬及馬有交叉反應。
    • OSM與狗和minipig產生交叉反應。
    • FGF-21與狗、minipig和馬產生交叉反應。

    請注意，本研究僅測試了有限數量的正常樣本，我們無法排除其他正常或疾病樣本中可能存在的交叉反應。

    添加回收率

    將已知量的各分析物（標準曲線上的點 3、4、5）添加到正常人血清/血漿樣本中。使用以下公式計算回收率百分比：

    分析物的計算濃度/預期濃度 *100

    所有添加樣品的回收率介於 70% 和 130% 之間。

    與其他多重檢測板間的一致性和準確性

    為了測試MILLIPLEX ®檢測之間的一致性和準確性。分析的一致性和準確性，我們比較了本人類肌動素板和其他MILLIPLEX®板中分析物質的定量。

    例如，使用 MILLIPLEX® 人類肌動素板、MILLIPLEX® 人類肝蛋白和人類 CVD1 板測量了 FGF-21 和 FABP3 的樣本值。使用純化的 FGF-21 標準品繪製標準曲線。兩個檢測板的 FABP3 顯示出重疊的檢測反應和檢測的線性範圍。檢測相關性極佳，斜率和 R 值接近一（圖 3）。

    圖表顯示比較多重檢測的 MFI 值。MILLIPLEX® 人類肌動蛋白檢測板與 MILLIPLEX® 肝病檢測板和 MILLIPLEX® 心血管疾病檢測板分別測量 FGF21（上）和 FABP3（下）的比較。

    圖 3. MILLIPLEX®與MILLIPLEX® Liver Panel 和 MILLIPLEX®CVD Panel 分別測量 FGF-21 (上圖) 和 FABP3 (下圖)。

    除了FGF-21和FABP3之外，我們還將此人類肌動素板中的相同分析物與其他MILLIPLEX®板進行了比較。

    正常樣本與敗血病樣本的比較

    最後，我們使用健康受試者和敗血病受試者的血清/血漿樣本對檢測面板進行了生物鑒定。不出所料，15 種新型肌動因子可同時透過檢測進行量化。在敗血症樣本中，FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21 和 Musclin 顯著上調（表 2）。

    正常樣本摘要資料 [pg/mL]

     ApelinFractalkineBDNFEPOSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinFSTL1IL-6FGF-21Musclin
    N8910111213141516171819202122
    平均 2281019,5481,239425,3431038,6251,9434956,491133134150
    最小值003500169,720000740000000000
    最大42026020,4803,460739,890302040,1103,1102,37017,170379570790
    % 可檢測888810063<10050133810038887588<6350
     

    Sepsis 樣品摘要資料 [pg/mL]

     ApelinFractalkineBDNFEPOSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinSPARCLIFIL-15MyostatinFABP3IrisinFSTL1OSMIL-6FGF-21Musclin
    N323334353637383940414243444546
    122789,2801,298544,95867<3,77738,9721,90514,632566432,016174
    最小值001100204,80000024000000<00
    最大46041020,18012,5201,258,000806031,600249,1409,06074,1703178,67912,40088...0*
    % Detectable<696910041100192528<10060849781 7559
     

    表2.正常和敗血症血清/血漿樣本中生物標誌物表達的比較。FABP3、Irisin、FSTL1、OSM、IL-6、FGF-21和Musclin在敗血症樣本中顯示上調。*未進行化驗。

    Summary

    The MILLIPLEX®人肌動蛋白檢測板靈敏、準確且可重複檢測。這款新的檢測板產生的樣本值與之前包含某些相同分析物的檢測板一致。本分析板為多樣化的研究領域提供理想的免疫分析，包括代謝、神經肌肉和特發性肌病疾病。

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    僅供研究使用。不可用於診斷程序。

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    參考資料

    1.
    Pedersen BK, Febbraio MA. 2012. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8(8):457-465. https://doi.org/10.1038/nrendo.2012.49
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    BKP,aLH. 2000. Exercise and the Immune System: Regulation, Integration, and Adaptation. https://doi.org/10.1152/physrev.2000.80.3.1055
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    Egan B, Zierath J. 2013. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17(2):162-184. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2012.12.012
    4.
    Jedrychowski MP, Wrann CD, Paulo JA, Gerber KK, Szpyt J, Robinson MM, Nair KS, Gygi SP, Spiegelman BM. 2015. Detection and Quantitation of Circulating Human Irisin by Tandem Mass Spectrometry.Cell Metab. 2015 Aug 12. pii: S1550-4131(15) 00392-7..
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