細胞訊號多重分析
使用 MILLIPLEX® 珠基多重分析法測量細胞信號通路的活化。使用基於 Luminex® xMAP® 技術的細胞信號磷酸蛋白檢測進行多重分析，有助於研究人員從單一樣本中測量同一通路或不同通路中的多種磷酸蛋白或總蛋白。請繼續閱讀，瞭解這項技術如何推進癌症、免疫學/發炎、毒性等方面的研究。
MILLIPLEX® 細胞內通路多重檢測試劑盒和檢測板經分析驗證，其性能標準與製造循環生物標誌物試劑盒時所採用的性能標準同樣嚴格，而且經過優化，可從珍貴的樣本中獲得最多數據。我們的細胞信號傳導檢測可以精確地相對量化信號傳導蛋白的總量和磷酸化形式，揭示您感興趣的通路中的連接和串聯。
這些經過分析驗證的細胞內通路檢測試劑盒提供：
- 刺激和非刺激細胞裂解液，以驗證分析性能
- 預混合磁珠，以捕捉感興趣的分析物質
- 檢測抗體雞尾酒，以在面板內產生一致的分析物質剖面相對的定量倍增數據（螢光強度中位數，MFI）
細胞信號多重分析如何用於研究
細胞訊號多重分析有助於比較樣本中磷蛋白和總蛋白的水平，從而深入瞭解不同的訊號傳導通路，包括cancer, inflammation, and even the 內大麻素系統。使用多重試劑盒分析細胞內通路的例子包括：
- Akt/mTOR
- 細胞凋亡
- Bcl-2家族
- DNA損傷/基因毒性
- MAPK/SAPK
- NFκB
具體而言，由於癌症和轉移涉及複雜的信號通路，因此細胞信號分析在癌症研究中非常重要。以下介紹研究人員如何在癌症研究中使用 MILLIPLEX® 細胞訊號多重分析的範例。
分析 Bcl-2 家族成員和蛋白質與蛋白質之間的相互作用
Bcl-2家族成員在內在凋亡通路中扮演非常重要的角色。該家族由超過 17 個成員組成，在功能上可區分為促凋亡亞家族和抗凋亡亞家族。這些家族成員之間的互作決定了細胞的命運，而調節失調可導致腫瘤生長和腫瘤細胞存活。
目前有幾種針對 Bcl-2 家族成員的癌症治療藥物正在臨床試驗中，這促使我們需要可靠的檢測方法來測量 Bcl-2 家族成員及其互作。雖然現有的檢測方法可測量 Bcl-2 家族成員，但缺乏可靠的檢測方法可同時評估總蛋白質和蛋白質與蛋白質之間的互作。為了解決這個問題，我們開發了兩種以 Luminex® 技術為基礎的多重免疫分析板，可在單孔中同時檢測 Bcl-2 家族的多種成分，包括總 Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、BAD、BIM 和 BAX，以及蛋白互作如 Mcl-1/BIM、Bcl-xL/BAD 和 NOXA/Mcl-1*（*資料未顯示）。
使用 MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 2
AT101, on the other hand, had no significant effect on either Mcl-1 levels or the Mcl-1/BIM interaction.
面板 2 對 MCF7 細胞株進行藥物劑量依賴性研究的資料。
圖 1.使用 MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 1 完成藥物劑量依賴性分析。用 0、1、2、5、10 和 20 μM 濃度的喜树碱、茴陽霉素和 AT101 處理 MCF7 細胞 16 小時。按照檢測方案（裂解液在 4°C 孵育過夜），將 20 μg 總蛋白稀釋在 MILLIPLEX® Assay Buffer 1 中進行分析。
圖 2. 使用 MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 2 完成藥物劑量依賴性分析。用 0、1、2、5、10 和 20 μM 濃度的喜树碱、茴陽霉素和 AT101 處理 MCF7 細胞 16 小時。根據檢驗規範（裂解液於 4°C 溫育過夜），以 MILLIPLEX® Assay Buffer 1 稀釋每份裂解液的 20 μg 總蛋白進行分析。注意，NOXA/Mcl-1 蛋白相互作用的數據未顯示。
總體而言，這些結果說明了 Bcl-2 家族對凋亡誘導藥物的動態反應。這裡描述的新型 MILLIPLEX® 多重免疫分析為研究調控 Bcl-2 蛋白家族的基本機制提供了強大的工具。
Specific Detection of Mutant Ras Oncoproteins in Cell and Tissue Lysates
Ras蛋白（HRAS、KRAS和NRAS）是小GTP酶，透過在非活性GDP結合和活性GTP結合狀態之間交替，發揮分子開關的功能。Ras-GTP 透過與 Raf 激酶和磷脂肌醇 3- 激酶 (PI3K) 結合，激活下游通路，包括 MAPK 通路，以促進細胞增殖、存活、生長和分化。大約 25% 的人類癌症中會發現 Ras 的致癌突變。此外，90% 的胰腺癌攜帶 KRAS 基因突變，其中 80% 的 KRAS 基因突變發生在第 12 個代碼，Ras G12V 和 G12D 是最常見的基因突變。BRAF 是一種成熟的致癌基因，BRAF V600E 基因突變在黑色素瘤中非常普遍。儘管針對這種 BRAF 腫瘤蛋白已有療效，但治療由 Ras 腫瘤蛋白驅動的癌症仍是尚未滿足的迫切臨床需求。
MILLIPLEX® Ras-Raf腫瘤蛋白磁珠檢測板，可在單孔中同時檢測總 Ras、Ras G12V、Ras G12D、磷酸化-MEK1 (S217/S221)、磷酸化-BRAF (S446) 和磷酸化-CRAF (S338)。此多重檢測可檢測總 Ras、RasG12D 及 RasG12V 的 H-Ras、N-Ras 及 K-Ras 異構體。為了確認特異性辨識突變的 Ras 腫瘤蛋白，本試劑盒可分別檢測在 COR-L23 細胞株中發現的已知 KRAS G12V 突变和在 THP-1 細胞株中發現的 NRAS G12D 突变（圖 3）。
圖 3. THP-1 cells and COR-L23 cells were treated with 2 μM vemurafenib or 125 nM dabrafenib for 72 hours before cells were harvested and cell lysates were analyzed using the MILLIPLEX® Ras-Raf Oncoprotein Panel。在這些缺乏 BRAF突變的細胞系中，沒有觀察到 vemurafenib 或 dabrafenib 的影響。
此外，使用多重免疫分析法比較了攜帶 BRAF V600E 突变的 MDA-MB-435S cells 和不敏感的細胞株對 BRAF 抑制劑 vemurafenib 和 dabrafenib 的反應（圖 4）。
圖 4. 用 2 μM vemurafenib 或 125 nM dabrafenib 處理帶有 BRAF V600E 突变的 MDA-MB-435S 細胞 72 小時。收穫細胞並使用 MILLIPLEX® Multi-Pathway、Ras-Raf Oncoprotein面板。
進一步，使用一名攜帶KRAS G12D突變的結腸癌患者的腫瘤和鄰近組織，分析了來自商業來源的組織裂解液。最後，從胰臟癌血清中富集外泌體，並使用Ras-Raf Oncoprotein Panel進行檢測（數據未顯示）。這些數據證明了在多種樣本類型（包括細胞、組織和外體裂解液）中使用 MILLIPLEX® 多重免疫分析法研究 Ras 腫瘤蛋白影響的效用。
使用 MILLIPLEX® Cell Signaling Assays 的訣竅
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下面介紹一些使用我們的 MILLIPLEX® 單重和多重細胞信號分析的技巧和訣竅。
Using Cell Signaling MAPmate™ (Singleplex) Assays
- 在現有的 MILLIPLEX® Cell Signaling 面板中複合上載控制 MAPmate™ 分析，以在方案中提供的指南內增強面板。
- 如果需要額外的緩衝液，可購買我們的細胞訊號緩衝液及amp; Detection Kit。
- 為了方便使用，附贈平底板。
"Plexing" Cell Signaling MAPmate™ Assays
- MAPmate™檢測可加到現有的細胞信號處理試劑盒中作為對照品。
96孔板中用於細胞信號分析的細胞裂解液的製備
- 對於黏附細胞株：每孔接種 ~40,000 個細胞，讓其生長 48 小時。
- 對於懸浮細胞株：每孔接種 ~250,000 個細胞，並在所需時間收集。
- 對於細胞裂解：每孔加入 30 µL 裂解緩衝液，上下徹底移液，不要產生太多氣泡。請向技術支援部門索取更詳細的方案。
Cell Signaling Phosphoprotein + Total 2-Plex Assays
- Directly compare the phosphoprotein vs.
- 與其他磷酸化/總蛋白 2 複合分析結合，同時研究多種蛋白的磷酸化和總表達
- 從多重信號傳導分析試劑盒中獲得相對量化的倍增數據
Singleplex MAPmate™ Loading Control Kits and Reagent Kits
- MAPmate™分析物是看家蛋白，你可以用現有的MILLIPLEX® Cell Signaling Panels作為載入控制
- 例外分析物是看家蛋白，您可以使用現有的 MILLIPLEX® Cell Signaling Panels 作為載入對照
- 例外：含panTyr檢測的試劑盒（如MILLIPLEX®T細胞受體信號磁珠7-Plex Kit)不能與這些上載對照進行複合分析 - MAPmate™試劑盒是單項檢測
- 每個上載控制 MAPmate™ 分析包括擷取抗體（與磁珠結合）和檢測抗體（與生物素結合）
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注意：若要檢視每種面板的分析物、磷酸化位點和物種反應性，請下載我們的Analyte Quarterly手冊。除了MILLIPLEX®RTK 磷酸蛋白磁珠面板可以定制外，所有試劑盒都有前綴。
僅供研究使用。
僅供研究使用，不得用於診斷程序。
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