Koniugaty Ni-NTA-Atto do czułego, specyficznego wykrywania białek znakowanych polihistydyną
Nowoczesne aplikacje rekombinowanych białek wymagają niezawodnych metod wykrywania. Polihistydyna jest jednym z najpopularniejszych znaczników powinowactwa dodawanych do rekombinowanych białek. Może być wstawiana na N- lub C-końcu i wyrażana w różnych gospodarzach. Ze względu na swój niewielki rozmiar, znacznik polihistydynowy służy jako eleganckie narzędzie zarówno do oczyszczania, jak i wykrywania białek. Immunodetekcja białek fuzyjnych znakowanych His na Western blot zazwyczaj wykorzystuje przeciwciało przeciwko polihistydynie, a następnie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna. Białko jest następnie wykrywane za pomocą odpowiedniego substratu enzymatycznego.
Koniugaty Ni-NTA-Atto zapewniają specyficzne i wysoce czułe wykrywanie białek fuzyjnych znakowanych His. Kompleks Ni-NTA-Atto (Nα,Nα-bis(karboksymetylo)-L-lizyna, kompleks niklu(II), sprzężony z barwnikiem Atto) jest specyficzny dla znaczników polihistydynowych przy minimalnej reaktywności krzyżowej. Barwniki Atto dostarczają silnych sygnałów fluorescencyjnych przy powszechnie dostępnych długościach fal i przy niewielkim wygaszaniu. Koniugaty Ni-NTA-Atto mogą być bezpośrednio nakładane na żel SDS-PAGE lub membranę Western blot w celu obrazowania fluorescencyjnego i były z powodzeniem stosowane w żywych komórkach.1,2 Wykrywanie za pomocą koniugatów Ni-NTA-Atto wymaga krótszego czasu inkubacji niż w przypadku wiązania białko-przeciwciało. Nie jest wymagana reakcja wtórna, ponieważ kompleks Ni-NTA jest bezpośrednio sprzężony z fluoroforem. Skutkuje to szybszą i bardziej elastyczną procedurą niż tradycyjna metoda immunodetekcji (Rysunek 1).
Rysunek 1.Porównanie wykrywania białek za pomocą tradycyjnej chemiluminescencyjnej immunodetekcji przeciwciał (po lewej) z wykrywaniem za pomocą koniugatu Ni-NTA-Atto (po prawej). Immunodetekcja odbywa się na membranie transferowej po Western blotting, podczas gdy koniugaty Ni-NTA-Atto mogą być stosowane zarówno z membranami transferowymi, jak i bezpośrednio na żelach SDS-PAGE po utrwaleniu.
Bezpośrednia detekcja białek znakowanych histydyną na żelach SDS-PAGE
Bezpośrednie zastosowanie koniugatów Ni-NTA-Atto na żelach SDS-PAGE zapewnia szybką i łatwą detekcję w celu monitorowania oczyszczania białek lub ekspresji białek w różnych punktach czasowych. Granica wykrywalności 50 ng dla p38 MAPK znakowanego His została zaobserwowana przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego (Rysunek 2).
Rysunek 2.Białko p38 MAPK znakowane His (500 ng - 25 ng) rozdzielono na 4-20% żelu Tris-Glycine SDS-PAGE. Żel utrwalono przez noc w 40% etanolu/10% kwasie octowym, przemyto wodą i inkubowano z Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) w ciemności. Żel przemyto, a następnie zobrazowano za pomocą skanera laserowego FLA-3000 Fuji® ze wzbudzeniem 633 nm i filtrem emisji 675 nm. Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm) jest wzbudzany w czerwonym obszarze widma.
Wykrywanie białek znakowanych histydyną po transferze Western Blot
Po elektroforezie białka mogą być przenoszone z żeli SDS-PAGE na membrany PVDF o niskiej fluorescencji, które są bardziej odporne na manipulacje. Tradycyjne Western bloty dobrze sprawdzają się w przypadku znaczników polihistydynowych, ale są czasochłonne. Koniugaty Ni-NTA-Atto łączą zalety wysoce specyficznego wykrywania z szybszą procedurą.
Aplikacja koniugatów Ni-NTA-Atto na membranę daje czułość porównywalną z bezpośrednim wykrywaniem żelu. Suszenie membrany zwiększa intensywność sygnału (Rysunek 3). Ponadto koniugaty Ni-NTA-Atto można usunąć z używanej membrany za pomocą 60-90-minutowej inkubacji w 20 mM EDTA.
Rysunek 3.Białko p38 MAPK znakowane His (500 ng - 25 ng) rozdzielono na 4-20% żelu SDS-PAGE. Białko przeniesiono na niskofluorescencyjną membranę PVDF, zablokowano na noc 5% BSA w PBS, przepłukano PBS-T i inkubowano z Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) w ciemności. Membranę przepłukano, a następnie zobrazowano za pomocą skanera laserowego FLA-3000 Fuji ze wzbudzeniem 633 nm i filtrem emisji 675 nm.
Porównanie procedur dla tradycyjnego Western immunoblot i koniugatów Ni-NTA-Atto przedstawiono w Tabeli 1. Bezpośrednie wykrywanie w żelu SDS-PAGE jest najwygodniejsze, ponieważ pomija etap transferu. Podobne limity detekcji z koniugatami Ni-NTA-Atto obserwuje się dla błon Western blot w porównaniu z żelami SDS-PAGE, ale bez ryzyka uszkodzenia żelu. W obu przypadkach czas pracy jest krótszy niż w przypadku tradycyjnej techniki przeciwciał.
Tabela 1.Porównanie protokołów tradycyjnego Western immunoblot, Western blot z użyciem koniugatu Ni-NTA-Atto i bezpośredniego wykrywania na żelu SDS-PAGE z użyciem koniugatu Ni-NTA-Atto. Roztwór podstawowy Ni-NTA-Atto przygotowuje się przez rozpuszczenie 250 μg w 250 μl PBS.
Koniugaty Ni-NTA-Atto stanowią cenną alternatywę dla tradycyjnej immunodetekcji przeciwciał w celu specyficznego i czułego wykrywania białek fuzyjnych znakowanych His. Zastosowanie Ni-NTA-Atto skraca czas eksperymentu i eliminuje czasochłonne eksperymenty walidacji przeciwciał, oszczędzając zarówno czas, jak i koszty.
Network error: Failed to fetch
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.
