Charakterystyka MALDI-TOF funkcjonalizowanych polimerów

Molly E. Payne, Scott M. Grayson

Department of Chemistry, Tulane University, New Orleans, Louisiana

Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na wysokowydajne i wyspecjalizowane materiały polimerowe, narzędzia do selektywnej funkcjonalizacji i modyfikacji grup końcowych stały się przedmiotem rozwoju syntetycznego. Ze względu na ich zmienne właściwości fizyczne i chemiczne, polimery są istotnym składnikiem różnych materiałów¹, biokoniugatów², makromonomerów³ i materiałów biomedycznych⁴.

Ze względu na ich złożoność i funkcjonalne ugrupowania, wiele docelowych kompleksów (np, materiałów biologicznie aktywnych) jest niekompatybilnych z warunkami polimeryzacji. Aby złagodzić te problemy, opracowano szeroką gamę metod syntetycznych w celu skutecznej koniugacji po polimeryzacji. Na przykład, grupy końcowe są często dodawane do polimerów w celu wykorzystania w reakcjach sprzęgania o wysokiej skuteczności, takich jak sprzęganie azydkowo-alkilowe⁵ i sprzęganie tiolowo-enowe⁶.

MALDI-TOF MS do charakteryzacji polimerów

Krytycznym ograniczeniem rozwoju funkcjonalizacji polimerów grupami końcowymi jest trudność w potwierdzeniu czystości grup końcowych przed i po modyfikacji. Nowoczesne techniki charakteryzacji, w szczególności spektrometria masowa MALDI-TOF (ang. matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry), okazały się nieocenione w potwierdzaniu wierności grup końcowych. MALDI-TOF to technika miękkiej jonizacji, która umożliwia rozdzielczość poszczególnych n-merów polimerów w rozkładzie widma masowego. Rozdzielczość ta umożliwia wyjaśnienie nie tylko rozkładu mas i masy jednostek powtarzalnych, ale także tożsamości i wierności grup końcowych.

Charakterystyka masy cząsteczkowej

Dla polimerów o stosunkowo niskiej dyspersji (Đ≤ 1,3), MALDI-TOF MS może być użyty do dokładnego określenia danych rozkładu masy. Średnia liczbowa masa cząsteczkowa (M_n) jest średnią masową w odniesieniu do liczby moli każdej frakcji masowej i może być obliczona za pomocą następującego wzoru:

Mn =	ΣNiMi
	ΣNi

gdzie N_i = liczba cząsteczek o określonej masie cząsteczkowej i M_i = określony ciężar cząsteczkowy tych cząsteczek

Średni ciężar cząsteczkowy (M_w) jest średnią masą w odniesieniu do masy każdej frakcji masowej i można go obliczyć za pomocą wzoru:

Mw =	ΣNiMi2
ΣNiMi

gdzie N_i = liczba cząsteczek o określonej masie cząsteczkowej i M_i = określony ciężar cząsteczkowy tych cząsteczek

Szerokość rozkładu ciężaru cząsteczkowego lub rozproszenie (Đ),  można określić ilościowo za pomocą stosunku M_w/M_n.

Charakterystyka grup końcowych

Oprócz zdolności do ilościowego określania rozkładów masy cząsteczkowej polimerów, MALDI-TOF MS może być również stosowany do określania grup końcowych homopolimerów. Można to osiągnąć poprzez przekształcenie następującego wzoru dla obserwowanej masy n-meru w widmie masowym (M_n-mer):

M_n-mer = n(M_RU) + M_EG1 + M_EG2 + M_ion gdzie n = stopień polimeryzacji,

M_EG1 = masa grupy α-końcowej grupy,

M_EG2 = masa ω-końcowej grupy,

M_RU = masa jednostki powtarzalnej polimeru

oraz M_ion = masa jonu kompleksującego z polimerem.

Charakterystyka MALDI-TOF komercyjnie dostępnych materiałów

Szeroka gama gotowych do użycia, sfunkcjonalizowanych polimerów jest komercyjnie dostępna do zastosowań biomedycznych, takich jak PEGylacja, synteza hydrożeli, ukierunkowane dostarczanie leków i biokoniugacja. Wykorzystaliśmy MALDI-TOF do weryfikacji dyspersyjności i funkcjonalności wybranych, wysoce zdefiniowanych, funkcjonalizowanych materiałów, które są obecnie dostępne. Wszystkie widma MALDI-TOF przedstawione poniżej pokazują pełne widmo z wstawką pojedynczego n-meru. Nasze wyniki weryfikują zarówno wąską dyspersję tych materiałów, jak i tożsamość i stopień funkcjonalizacji tych wybranych materiałów.

Produkt 689696: bisazyd poli(glikolu etylenowego) (M_n=2000)

.

Rysunek 1. Wizualna obserwacja widm potwierdza, że polimer ma wąski, monomodalny rozkład. Rozkład masy cząsteczkowej dla tego polimeru obliczono na Mn: 1940 i Mw: 1950, co prowadzi do wąskiego rozkładu z Đ = 1,01. Piki w widmie odpowiadają pojedynczemu rozkładowi z każdym pikiem oddzielonym 44,026 jednostkami masy, co sugeruje, że w tej próbce istnieje tylko jeden zestaw grup końcowych. Grupy końcowe można zweryfikować, patrząc na poszczególne n-mery, takie jak 41-mer [Rysunek 1b]. Teoretyczna wartość masy 42-meru z dwoma azydkowymi grupami końcowymi wynosi 1984,13978, co zostało obliczone przez pomnożenie masy jednostki powtórzonej (44,02621) przez liczbę jednostek powtórzonych (42), dodanie masy azydowej grupy końcowej (42,00922), dodanie masy azydoetylowej grupy końcowej (70,04052), a na koniec dodanie masy kationu sodu (22,98922). Zaobserwowana wartość dla 42-meru wynosi 1983,95, co różni się o 0,19 Da od wartości teoretycznej.

Produkt 747386: Poli(L-laktyd), zakończony tiolem (M_n=2,500)

.

Rysunek 2. Wizualna obserwacja widm potwierdza, że polimer ma wąski, monomodalny rozkład. Rozkład masy cząsteczkowej dla tego polimeru obliczono na Mn: 2300, Mw: 2350, i Đ =1,02. Główne piki w widmach odpowiadają pojedynczemu rozkładowi z każdym pikiem oddzielonym 72,021 jednostkami masy, co sugeruje, że w tej próbce istnieje tylko jeden zestaw grup końcowych. Grupy końcowe zweryfikowano, patrząc na pojedynczy 26-mer [Rysunek 2b]. Teoretyczna wartość masy 26-meru z grupami końcowymi -hydroksy i ω-tiolu wynosi 1973,55254, co różni się o 0,07 Da od obserwowanej masy 1973,62 Da. Pomiędzy każdym głównym pikiem w tym materiale występują bardzo małe piki. Patrząc konkretnie na mniejsze piki obserwowane we wstawce, pik przy 2045.74 odpowiada 27-merowi polimeru, a pik przy 2057.73 odpowiada polimerowi zakończonemu kwasem karboksylowym (zamiast funkcjonalności tiolowej). Te drobne zanieczyszczenia są prawdopodobnie spowodowane albo inicjacją wody w polimeryzacji z otwarciem pierścienia monomeru laktydu, albo transestryfikacją.

Charakterystyka MALDI-TOF polimerów po reakcjach koniugacji

Podczas gdy wiele typów reakcji jest wykorzystywanych do ułatwienia koniugacji polimerów, reakcje typu click są szeroko stosowane ze względu na ich łatwość, wydajność i szeroką kompatybilność grup funkcjonalnych. Spopularyzowana przez Sharpless et al.⁷, katalizowana miedzią cykloaddycja azydkowo-alkilowa (CuAAC)⁵ sprzęga odczynnik alkinowy z odczynnikiem azydkowym poprzez utworzenie pierścienia 1,2,3-triazolowego. Grupa Bertozzi opracowała promowaną przez szczep cykloaddycję alkinu z azydkiem (SPAAC)⁸ między odczynnikiem azydkowym i cyklooktenowym, jako alternatywę bez miedzi do stosowania z żywymi komórkami i in vivo. Reakcje typu "click" tiol-en⁶ pomiędzy alkenem i odczynnikiem tiolowym w celu utworzenia siarczku alkilu są również użytecznymi alternatywami niezawierającymi metali ze względu na ich kompatybilność z szeregiem zastosowań, zwłaszcza biologicznych. Ponadto, ponieważ aminy są wszechobecne w przyrodzie i biologii, reakcje amidowania⁹ między kwasami karboksylowymi i aminami są szczególnie ważne w syntezie peptydów, białek i ich koniugatów.

Podczas gdy reakcje typu "click" charakteryzują się wysoką konwersją, potwierdzenie zakończenia reakcji może być trudne w przypadku reakcji koniugacji polimerów.  Ze względu na niskie względne stężenie nowo utworzonego wiązania w porównaniu do jednostek powtarzalnych polimeru, tradycyjne metody charakteryzacji (np,¹H NMR) zazwyczaj nie są wystarczająco czułe do weryfikacji. W przeciwieństwie do tego, MALDI-TOF może być użyty do rozdzielenia grup końcowych i potwierdzenia zakończenia reakcji. Poniższe przykłady przedstawiają dwa różne typy reakcji typu "click" i potwierdzają, że pożądany związek został utworzony. Widma MALDI-TOF dostarczone dla każdej reakcji pokazują widmo materiału wyjściowego powyżej i produktu końcowego poniżej.

Modyfikacja bis-azidu poli(glikolu etylenowego) (produkt 689696) 1-etynylo-4-fluorobenzenem za pomocą CuAAC

Rysunek 3. Przedstawia widma MALDI-TOF bis(azydku) polioksyetylenu (Mn=2000) (czerwony) zmodyfikowanego 1-etynylo-4-fluorobenzenem poprzez cykloaddycję azydkowo-alkilową (niebieski). Wizualna obserwacja widm potwierdza, że nastąpiła modyfikacja, ale można to również potwierdzić na podstawie różnicy mas między wybranymi n-merami. Jak pokazano czarną strzałką, zaobserwowano przesunięcie o 240,21 Da między materiałem wyjściowym a produktem. Odpowiada to różnicy w 42-merze materiału wyjściowego (1983,95) w porównaniu do 42-meru produktu (2224,16) i jest w ścisłej zgodności z teoretyczną dokładną różnicą mas wynoszącą 240,08.

Modyfikacja zakończonego tiolem poli(L-laktydu)(Produkt 747386) z 2,5-pirolodionem poprzez reakcję kliknięcia tiol-enu

Rysunek 4. Przedstawia widma MALDI-TOF zakończonego tiolem poli(L-laktydu) (fioletowy) zmodyfikowanego 2,5-pirolodionem (zielony) poprzez sprzężenie tiol-en. Wizualna obserwacja całego widma potwierdza, że materiał wyjściowy przeszedł pewien rodzaj modyfikacji, ale zakończenie reakcji tiol-en można potwierdzić, badając przesunięcie poszczególnych n-merów. Wskazane czarną strzałką, obserwuje się przesunięcie o 97,02 Da od 26-meru materiału wyjściowego (1973.55) do 26-meru produktu (2214.56), co odpowiada przesunięciu masy, którego można by oczekiwać po reakcji tiol-en.

Wnioski

Dostępne na rynku polimery o różnych masach cząsteczkowych, składach i funkcjonalnościach grup końcowych stały się kluczowym składnikiem wielu zastosowań. Dzięki odpowiedniej grupie końcowej, funkcjonalizowane polimery mogą zapewnić szybką i wydajną drogę do syntezy szerokiej gamy koniugatów polimerowych. Ponieważ złożoność tych materiałów wzrasta, aby zaspokoić potrzeby naukowców, MALDI-TOF MS jest cennym narzędziem do potwierdzania tożsamości grup końcowych i transformacji, weryfikując udaną i pełną koniugację.

Referencje

1. Brinson HF, Brinson LC. 2008. Polymer Engineering Science and Viscoelasticity. https://doi.org/10.1007/978-0-387-73861-1

2. Lutz J, Börner HG. 2008. Modern trends in polymer bioconjugates design. Progress in Polymer Science. 33(1):1-39. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2007.07.005

3. Plate N, Valuyev L, Chupov V. 1985. Synthesis and polymerization of macromonomers based on physiologically active compounds. Review. Polymer Science U.S.S.R.. 27(10):2265-2282. https://doi.org/10.1016/0032-3950(85)90302-8

4. Green JJ, Elisseeff JH. 2016. Mimicking biological functionality with polymers for biomedical applications. Nature. 540(7633):386-394. https://doi.org/10.1038/nature21005

5. Meldal M, Tornøe CW. 2008. Cu-Catalyzed Azide?Alkyne Cycloaddition. Chem. Rev.. 108(8):2952-3015. https://doi.org/10.1021/cr0783479

6. Hoyle C, Bowman C. 2010. Thiol-Ene Click Chemistry. Angewandte Chemie International Edition. 49(9):1540-1573. https://doi.org/10.1002/anie.200903924

7. Rostovtsev V, Fokin V, Sharpless Angew KB. 2002.(41):2596-2599.

8. Baskin JM, Prescher JA, Laughlin ST, Agard NJ, Chang PV, Miller IA, Lo A, Codelli JA, Bertozzi CR. 2007. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104(43):16793-16797. https://doi.org/10.1073/pnas.0707090104

9. Montalbetti CA, Falque V. 2005. Amide bond formation and peptide coupling. Tetrahedron. 61(46):10827-10852. https://doi.org/10.1016/j.tet.2005.08.031