Funkcjonalizowany PEI i jego rola w terapii genowej

Bettina Schwarz¹, Olivia M. Merkel^{1, 2*}

¹Department of Pharmacy, Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, Ludwig-Maximilians-Universität München, Butenandtstraße 5, 81377 München, Germany, ²Nanosystems Initiative Munich (NIM), Ludwig-Maximilians-Universität München, Schellingstraße 4, 80799 München, Germany

Material Matters, 2017, 12.2

Olivia.merkel@lmu.de

Wprowadzenie

Terapia genowa stała się jedną z najczęściej omawianych technik w badaniach biomedycznych w ostatnich latach. Terapia genowa polega na leczeniu różnych chorób i zaburzeń genetycznych poprzez dostarczanie materiałów genetycznych do komórek. Jednak sukces tej metody leczenia jest nadal ograniczony ze względu na brak bezpiecznych i wydajnych systemów nośnikowych.

Poli(etylenoimina) (PEI) była szeroko badana jako najnowocześniejszy nośnik genów do in vitro oraz in vivo aplikacji. PEI łatwo tworzy polipleksy z kwasami nukleinowymi poprzez elektrostatyczną samoorganizację. Polipleksy zapewniają wyższą wydajność transfekcji ze względu na wysoką zdolność buforowania PEI, co jest korzystne dla endosomalnej ucieczki ładunku genowego.¹ Pomimo tych zalet, PEI nie ulega degradacji, nie jest specyficzny, daje z natury niestabilne kompleksy i agreguje we krwi, co powoduje wysoką toksyczność. Znaczny nacisk położono na modyfikację PEI i jej odpowiedni wpływ na dostarczanie genów. Chociaż wykazano, że PEI o niskiej masie cząsteczkowej jest mniej cytotoksyczny in vivo niż pochodne o wysokiej masie cząsteczkowej,² niska masa cząsteczkowa PEI skutkuje zmniejszoną wydajnością transfekcji. Opierając się na tych wynikach, obecne badania koncentrują się na projektowaniu degradowalnych pochodnych PEI przy użyciu PEI o niskiej masie cząsteczkowej i różnych środków sieciujących. Co więcej, różne polimery i ligandy zostały użyte w celu zwiększenia wydajności transfekcji i specyficzności docelowej.

Niniejszy przegląd koncentruje się na aktualnych postępach w rozwoju zmodyfikowanych pochodnych PEI jako nośników genów dla małych interferujących RNA (siRNA) i DNA oraz krótko opisuje różne modyfikacje chemiczne PEI poparte wynikami in vivo . Omówione tematy obejmują polimery sprzężone z PEI w celu zwiększenia stabilności polipleksu, wydajności transfekcji oraz dodania ligandów celujących i biodegradowalnych wiązań.

Modyfikacje PEI poprzez funkcjonalizację polimerów

Pomimo swoich unikalnych właściwości, niezmodyfikowany PEI cierpi z powodu cytotoksyczności, braku biodegradowalności, słabej wydajności transfekcji homologów o niskiej masie cząsteczkowej i niewystarczającej specyficzności docelowej. Aby uzyskać bardziej wydajne niewirusowe wektory do dostarczania genów, w ciągu ostatnich kilku lat duży nacisk położono na modyfikacje PEI. Polimery, ligandy i modyfikacje chemiczne zostały wykorzystane do poprawy właściwości fizykochemicznych PEI, a także zwiększenia jego biokompatybilności i wydajności transfekcji. Modyfikacja PEI polimerami w celu zwiększenia wydajności transfekcji cieszy się dużym zainteresowaniem i wykorzystuje szeroką gamę polimerów, w tym oligosacharydy, poli(glikol etylenowy) (PEG), poli(ε-kaprolakton) i inne. Najpopularniejsze i najnowsze modyfikacje opisano pokrótce poniżej.

PEG

Jedną z pierwszych i najszerzej badanych modyfikacji PEI jest kowalencyjne sprzęganie poli(glikolu etylenowego) (PEG) (Rysunek 1). Ponieważ PEG jest niejonowy i rozpuszczalny w wodzie, koniugacja z PEG poprawia biokompatybilność, zmniejsza cytotoksyczność i wydłuża czas krążenia in vivo.³ Mao et. ⁴ stwierdzili, że zarówno długość łańcucha, jak i gęstość szczepu PEG silnie wpływają na kondensację siRNA i stabilność polipleksu in vitro. Chociaż przeprowadzono ogromną liczbę badań in vitro, in vivo eksperymenty pokazujące efekty kompleksów PEG-PEI/siRNA są niezbędne do walidacji nowych materiałów. Merkel i wsp.⁵ badali dostarczanie polipleksów PEGPEI do płuc myszy. Wstępne wyniki in vitro  sugerowały, że PEI/siRNA bez PEG miał najmniejszą immunogenność i najlepszą stabilność, ale wyniki te nie zostały poparte późniejszymi eksperymentami in vivo knockdown. We wtórnych eksperymentach kompleksy PEG-PEI/siRNA wykazywały wyższą stabilność i podwyższoną odpowiedź immunologiczną, ale nie wykazywały nieprawidłowości histologicznych, podczas gdy niezmodyfikowane kompleksy PEI/siRNA osadzały PEI w płucach i zbyt wcześnie uwalniały ładunek siRNA.

Rysunek 1. Przykładowa struktura modyfikacji PEI za pomocą PEG.

Sacharydy

Ze względu na biodegradowalność, biokompatybilność i niską toksyczność, chitozan jest najczęstszym polisacharydem stosowanym do szczepienia na PEI. Aby przezwyciężyć słabą skuteczność transfekcji, zmodyfikowane pochodne, takie jak chitozan glikolowy, zostały przyłączone do polimerów PEI.⁶ Ten nośnik genów zmniejsza cytotoksyczność PEI, jednocześnie zwiększając ucieczkę endosomalną i skuteczność transfekcji GFP w komórkach HEK 293. Oprócz polisacharydów, oligosacharydy są często stosowane do zmiany właściwości farmakokinetycznych PEI. Gutsch i wsp.⁷ zbadali zestaw różnych kompleksów DNA i siRNA na bazie oligomaltozy-PEI pod kątem ich biokompatybilności i skuteczności in vivo. Stwierdzono, że PEI szczepione oligomaltozą zwiększa skuteczność dostarczania DNA, zmniejsza utratę masy ciała, znosi hepatotoksyczność i znosi śmiertelność myszy w badaniu w porównaniu z wolnymi polimerami. Innym interesującym podejściem jest wykorzystanie nanokryształów celulozy (CNC) jako nośników do dostarczania siRNA.⁸ Te przypominające pręciki nanocząstki charakteryzują się biodegradowalnością, brakiem cytotoksyczności i zwiększonym wychwytem komórkowym. W niedawnym raporcie CNC zostały pokryte kowalencyjnie przyłączoną, kationową powłoką PEI zdolną do wiązania siRNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Ten nowy nanonośnik wykazał brak cytotoksyczności i dobrą wydajność transfekcji w porównaniu z komercyjnym odczynnikiem do transfekcji in vitro.

Polilaktyd

Aby zwiększyć hydrofobowość w celu lepszej penetracji komórek i ogólnej biodegradowalności, Abebe i wsp.⁹ zaprojektowali kopolimery trójblokowe składające się z liniowego PEI, PEG i poli(l-laktydu) (PLLA). Przygotowali wielowarstwowe micele z PLLAPEI- PLLA jako hydrofobowym rdzeniem zamykającym materiał genetyczny i PLLA-PEG-PLLA jako zewnętrzną powłoką zapewniającą stabilność w zawiesinach wodnych. Powstałe micele wykazują niską cytotoksyczność i wysoką stabilność przy neutralnym pH, ale zewnętrzna powłoka łatwo destabilizuje się w kwaśnych warunkach, natychmiast uwalniając kwasy nukleinowe.

Inne polimery

Istnieje wiele innych sposobów modyfikacji PEI za pomocą różnych kopolimerów, aby uzyskać lepszą skuteczność transfekcji i zmniejszoną cytotoksyczność. Wielofunkcyjny, kationowy kopolimer trójblokowy oparty na PEG, poli(ε-kaprolaktonie) (PCL) i PEI został zaprojektowany do dostarczania siRNA.¹⁰ Hydrofobowa domena PCL zwiększyła powinowactwo do błony komórkowej, utrzymując lepszą internalizację. Ponieważ warstwa ta może również służyć jako rezerwuar dla substancji hydrofobowych, system może być potencjalnie wykorzystywany do jednoczesnego dostarczania kwasów nukleinowych i hydrofobowych leków lub barwników. Te hydrofobowe, amfifilowe nanonośniki wykazały doskonałą skuteczność transfekcji, gdy zostały dostarczone do płuc myszy BALB/c poprzez inhalację. Koniugaty PEI z jednościennymi nanorurkami węglowymi mogą być również stosowane w celu zmniejszenia cytotoksyczności PEI przy jednoczesnym zwiększeniu jego skuteczności transfekcji.¹¹

Nanonośnik ten wykorzystuje zarówno opartą na morfologii penetrację komórek przez nanorurki węglowe, jak i zdolność PEI do ucieczki endosomalnej. Oprócz zwiększonej wydajności transfekcji i niskiej cytotoksyczności, do nanokonstrukcji włączono wiązania dwusiarczkowe w celu zwiększenia biodegradowalności. W porównaniu do 25 kDa PEI, nanonośniki wykazały ponad 800-krotnie wyższe poziomy transfekcji in vitro.

Ligand-Modified PEI

Idealny system dostarczania genów powinien dostarczać nienaruszone kwasy nukleinowe bez skutków ubocznych, zapewniając jednocześnie podstawę do celowania specyficznego dla komórek lub tkanek. Wiele badań in vivo wykazało niezdolność materiału genetycznego do przedostania się do jądra komórkowego. Aby przezwyciężyć tę wadę i zwiększyć skuteczność celowania polipleksów opartych na PEI, polimer musi być modyfikowany za pomocą różnych ligandów celujących.

Peptydy

Specyficzne sekwencje peptydowe, które oddziałują z receptorami wyrażanymi głównie przez komórki nowotworowe, mogą być włączone w celu ułatwienia penetracji komórek i jądra. Hu i wsp.¹² zaprojektowali wektor na bazie PEI zmodyfikowany trójfunkcyjnym peptydem R18, który zawiera TAT (peptyd penetrujący komórki), RGDC (peptyd adhezyjny komórek) i sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS), w celu zwiększenia importu jądrowego materiału genetycznego. Nanowektor ten wykazał kontrolowaną degradację, wysoką zdolność buforowania i niską cytotoksyczność. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła akumulację w jądrze po pobraniu przez komórki. Ponadto, wyniki in vivo u myszy potwierdzają znaczenie fragmentu NLS dla zwiększenia wydajności transfekcji jądrowej, w porównaniu do kompleksu bez sekwencji NLS lub jakiejkolwiek modyfikacji peptydowej.

Neutralizacja ładunku powierzchniowego

Wykazano, że neutralizacja ładunku powierzchniowego PEI zwiększa biokompatybilność i wydajność internalizacji komórek.¹³ Wykazano, że podstawienie pierwszorzędowych amin PEI grupami hydrazydowymi pozwala na dalszą modyfikację ligandami celującymi. Pomimo tych modyfikacji, "efekt gąbki protonowej" pozostaje niezmieniony ze względu na niezmodyfikowane aminy drugorzędowe i trzeciorzędowe poli(etylenoiminy). Otrzymane polimery były wrażliwe na pH i nie wykazywały cytotoksyczności w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), co sugeruje, że pierwszorzędowe aminy znajdujące się w PEI są głównie odpowiedzialne za jego działanie cytotoksyczne. Z adhezyjnym peptydem RGD jako docelowym ligandem, nanokompleksy te były w stanie ułatwić wchłanianie siRNA do serc danio pręgowanego.

Kwas foliowy

Większość komórek nowotworowych (i subpopulacja makrofagów) wykazuje nadekspresję receptorów kwasu foliowego na swojej powierzchni. W następstwie fundamentalnej pracy Abebe i wsp.,⁹ Mohammadi i wsp.¹⁴ wykorzystali micele dekorowane kwasem foliowym do namierzania aktywowanych makrofagów w stawach objętych stanem zapalnym (rysunek 2). Wewnętrzny rdzeń miceli składał się z kopolimerów blokowych PLLA-PEI-PLLA, podczas gdy zewnętrzna warstwa została przygotowana z różnych proporcji PLLA-PEG-PLLA i kwasu foliowego (FA) -PEG-PLLA. Stwierdzono, że 75% FA-PEG-PLLA i 25% PLLA-PEG-PLLA to optymalny skład dla skutecznej enkapsulacji plazmidowego DNA, wychwytu komórkowego i ukierunkowania na makrofagi. Dzięki tej kompozycji uzyskano znacznie wyższą ekspresję GFP w aktywowanych makrofagach RAW 264.7 ex vivo, w porównaniu do niecelowanych miceli i nieaktywowanych makrofagów.

Rysunek 2. Formułowanie niecelowanych i celowanych trójwarstwowych miceli w 2-etapowym procesie. W zależności od zastosowania samego PLLA-PEG-PLLA lub mieszanki PLLA-PEG-PLLA z PLLA-PEG-FA dla warstwy zewnętrznej, otrzymano odpowiednio niecelowane lub celowane w receptor folianowy micele trójwarstwowe. Przedrukowano za zgodą Mohammadi et al.14 Copyright 2016 Elsevier.

Transferyna

Najbardziej ugruntowane i skuteczne podejście do skutecznego ekranowania polipleksów wykorzystuje wysoce hydrofilową, ujemnie naładowaną glikoproteinę surowicy - transferynę (Tf). Ligand ten łączy w sobie zarówno wewnętrzny efekt ukrycia, jak i ukierunkowanie na komórki wyrażające receptor transferyny,² eliminując potrzebę stosowania powłoki PEG w celu ochrony dodatniego ładunku kompleksu Tf-PEI/DNA. Ten system dostarczania genów wykazuje nie tylko zmniejszoną agregację erytrocytów w porównaniu z jego pochodną PEGylowaną, ale także zmniejszoną cytotoksyczność (Rysunek 3). Co więcej, wzorzec biodystrybucji został przesunięty z wątroby i płuc, co jest typowe dla nieekranowanych kompleksów, do ekspresji transgenu głównie w docelowym guzie in vivo. W ten sposób transferyna może być stosowana jako składnik ekranujący i celujący, aby skutecznie dostarczać materiał genetyczny do komórek nowotworowych.

Rysunek 3. Inkorporacja transferyny zmniejsza agregację erytrocytów. Świeże erytrocyty mysie inkubowano z kompleksami PEI/DNA lub Tf-PEI/PEI/DNA (N/P = 4,8) przez 1 h w 37 °C. A) Tf-PEI/PEI/DNA, B) PEI/DNA, C) kontrola. Zaadaptowano za zgodą Kircheis et al.2 Copyright 2002 Nature Publishing Group.

Chemicznie modyfikowany PEI

Poli(etylenoimina) jest uważana za złoty standard polimerowych nośników genów ze względu na jej wysoką zdolność buforowania endosomalnej ucieczki genów, ale jest poważnie ograniczona przez jej wysoką toksyczność komórkową. Cytotoksyczność PEI zależy od jego degradowalności, masy cząsteczkowej i struktury. W tej sekcji opisujemy dwa z najczęstszych wiązań włączonych do pochodnych PEI w celu uzyskania degradowalnych analogów.

Wiązania estrowe

Pochodne PEI zawierające wiązania estrowe mogą być przygotowane przez addycję Michaela PEI do diakrylanów, które działają jako sieciujące. Wang i wsp.¹⁵ połączyli rozgałęziony PEI o niskiej masie cząsteczkowej z różnymi diakrylanami Pluronic^® . Otrzymane poli(aminy estrowe) (PEA) zostały dokładnie przebadane in vitro oraz in vivo. PEA wykazały ograniczoną cytotoksyczność wobec komórek C2C12 i CHO, nawet w wysokich stężeniach, podczas gdy żywotność komórek spadła do mniej niż 15% przy użyciu standardowego PEI (25 kDa). Ponadto osiągnięto znaczną poprawę skuteczności dostarczania genów do komórek CHO, C2C12 i HSkM, a także skuteczną transfekcję u myszy mdx.

Wiązania dwusiarczkowe

Stężenie glutationu i innych czynników redukujących jest znacznie wyższe w cytoplazmie niż w osoczu, nadając wysoką wewnątrzkomórkową zdolność redukcji w porównaniu do środowiska zewnątrzkomórkowego. Materiały wrażliwe na redoks zazwyczaj zawierają degradowalne wiązania dwusiarczkowe w swoim szkielecie, ponieważ wiązania te ulegają degradacji w środowisku redukującym. Pobór komórkowy z szybkim wewnątrzkomórkowym uwalnianiem siRNA in vitro zaobserwowano przy użyciu usieciowanego disiarczkiem, silnie rozgałęzionego PEI w porównaniu do niezmodyfikowanego liniowego i rozgałęzionego PEI.¹⁶ Neu et al.¹⁷ użyli odczynnika sieciującego o niskiej masie cząsteczkowej, propionianu ditiobis(sukcynimidylu) (DSP), do wytworzenia usieciowanych polipleksów PEI bez dodatkowej stabilizacji sterycznej hydrofilowych kopolimerów (rysunek 4). Te polipleksy były porównywalne pod względem wielkości i właściwości kondensacji DNA i były skutecznie pobierane przez komórki in vitro z wyzwalanym redoks uwalnianiem DNA. In vivo eksperymenty na myszach wykazały zwiększone stężenie we krwi. Test lucyferazy wykazał zwiększoną ekspresję w wątrobie i zmniejszoną niepożądaną 0 h 4 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h transfekcję płuc. Wyniki te pokazują, że PEI usieciowany DSP tworzy redukowalne wiązania dwusiarczkowe, które mogą wydłużyć czas krążenia i utrzymać skuteczność transfekcji. Dodatkowo Zhang i wsp.¹⁸ zwiększyli dostarczanie DNA i wydajność transfekcji przy jednoczesnym zmniejszeniu cytotoksyczności (in vitro oraz in vivo) poprzez sprzężenie redukowalnego, związanego disiarczkiem PEI z biokompatybilnym Pluronic^®.

Rysunek 4. Schemat reakcji konwersji pierwszorzędowych amin PEI z propionianem ditiobis(sukcynimidylu) (DSP). Powstałe wiązania dwusiarczkowe są łatwo rozszczepiane przez środki redukujące.

Wnioski

Jako jeden z najczęściej badanych niewirusowych wektorów do dostarczania kwasów nukleinowych, PEI ma znaczący potencjał w zastosowaniach terapii genowej. Ze względu na zdolność do kondensacji RNA/DNA, wychwytu komórkowego i ucieczki endosomalnej, poli(etylenoimina) jest odpowiednim kandydatem do dostarczania terapeutycznych kwasów nukleinowych in vivo. Chociaż niemodyfikowane nośniki oparte na PEI zostały uznane za złoty standard, PEI ma kilka kluczowych wad, takich jak cytotoksyczność, brak specyficzności docelowej i wydajność transfekcji. Podjęto znaczne wysiłki w celu oceny różnych modyfikacji PEI i przezwyciężenia tych wad. Osiągnięto obiecujące wyniki w zakresie specyficzności docelowej, wydajności transfekcji i biodegradowalności, ale nadal istnieje znaczne pole do poprawy. W ciągu ostatnich dwóch dekad poczyniono znaczne postępy w stosowaniu degradowalnych systemów dostarczania opartych na PEI, poprawiając zarówno bezpieczeństwo, jak i siłę działania. Naukowcy opracowali również wielofunkcyjne polipleksy do dostarczania genów za pośrednictwem receptorów in vivo (Rysunek 5),¹⁹ niektóre z nich mogą być stosowane w diagnostyce (bioobrazowanie) i terapii, poprzez dostarczanie genów w tym samym czasie (teranostyka).²⁰ Konieczne są jednak dalsze badania in vivo w celu zbadania dodatkowych właściwości farmakodynamicznych, farmakokinetycznych i immunogennych; poprawa potencjału nośników genów opartych na PEI do zastosowań klinicznych.

Rysunek 5. Wewnątrznowotworowe wstrzyknięcie polipleksów siRNA. Retencja ukierunkowanych polipleksów w miejscu guza określona za pomocą bioobrazowania fluorescencyjnego NIR. Polipleksy znakowane kwasem foliowym (góra), nie znakowane polipleksy (środek) i równe ilości (25 μg) wolnego siRNA znakowanego Cy7 (dół). Adaptacja za zgodą Dohmen et al.19 Copyright 2012 American Chemical Society

Referencje

1. Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JP. 1995. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92(16):7297-7301. https://doi.org/10.1073/pnas.92.16.7297

2. Kircheis R, Wightman L, Schreiber A, Robitza B, Rössler V, Kursa M, Wagner E. 2001. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8(1):28-40. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3301351

3. Neu M, Germershaus O, Behe M, Kissel T. 2007. Bioreversibly crosslinked polyplexes of PEI and high molecular weight PEG show extended circulation times in vivo. Journal of Controlled Release. 124(1-2):69-80. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2007.08.009

4. Mao S, Neu M, Germershaus O, Merkel O, Sitterberg J, Bakowsky U, Kissel T. 2006. Influence of Polyethylene Glycol Chain Length on the Physicochemical and Biological Properties of Poly(ethylene imine)-graft-Poly(ethylene glycol) Block Copolymer/SiRNA Polyplexes. Bioconjugate Chem.. 17(5):1209-1218. https://doi.org/10.1021/bc060129j

5. Merkel OM, Beyerle A, Librizzi D, Pfestroff A, Behr TM, Sproat B, Barth PJ, Kissel T. 2009. Nonviral siRNA Delivery to the Lung: Investigation of PEG?PEI Polyplexes and Their In Vivo Performance. Mol. Pharmaceutics. 6(4):1246-1260. https://doi.org/10.1021/mp900107v

6. Taranejoo S, Chandrasekaran R, Cheng W, Hourigan K. 2016. Bioreducible PEI-functionalized glycol chitosan: A novel gene vector with reduced cytotoxicity and improved transfection efficiency. Carbohydrate Polymers. 153160-168. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.07.080

7. Gutsch D, Appelhans D, Höbel S, Voit B, Aigner A. 2013. Biocompatibility and Efficacy of Oligomaltose-Grafted Poly(ethylene imine)s (OM-PEIs) for in Vivo Gene Delivery. Mol. Pharmaceutics. 10(12):4666-4675. https://doi.org/10.1021/mp400479g

8. Ndong Ntoutoume GM, Grassot V, Brégier F, Chabanais J, Petit J, Granet R, Sol V. 2017. PEI-cellulose nanocrystal hybrids as efficient siRNA delivery agents?Synthesis, physicochemical characterization and in vitro evaluation. Carbohydrate Polymers. 164258-267. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2017.02.004

9. Abebe DG, Kandil R, Kraus T, Elsayed M, Merkel OM, Fujiwara T. 2015. Three-Layered Biodegradable Micelles Prepared by Two-Step Self-Assembly of PLA-PEI-PLA and PLA-PEG-PLA Triblock Copolymers as Efficient Gene Delivery System. Macromol. Biosci.. 15(5):698-711. https://doi.org/10.1002/mabi.201400488

10. Endres T, Zheng M, K?l?ç A, Turowska A, Beck-Broichsitter M, Renz H, Merkel OM, Kissel T. 2014. Amphiphilic Biodegradable PEG-PCL-PEI Triblock Copolymers for FRET-Capable in Vitro and in Vivo Delivery of siRNA and Quantum Dots. Mol. Pharmaceutics. 11(4):1273-1281. https://doi.org/10.1021/mp400744a

11. Nia AH, Eshghi H, Abnous K, Ramezani M. 2017. The intracellular delivery of plasmid DNA using cationic reducible carbon nanotube ? Disulfide conjugates of polyethylenimine. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 100176-186. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2017.01.014

12. Hu J, Zhu M, Liu K, Fan H, Zhao W, Mao Y, Zhang Y. A Biodegradable Polyethylenimine-Based Vector Modified by Trifunctional Peptide R18 for Enhancing Gene Transfection Efficiency In Vivo. PLoS ONE. 11(12):e0166673. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0166673

13. Wang F, Gao L, Meng L, Xie J, Xiong J, Luo Y. 2016. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8(49):33529-33538. https://doi.org/10.1021/acsami.6b13295

14. Mohammadi M, Li Y, Abebe DG, Xie Y, Kandil R, Kraus T, Gomez-Lopez N, Fujiwara T, Merkel OM. 2016. Folate receptor targeted three-layered micelles and hydrogels for gene delivery to activated macrophages. Journal of Controlled Release. 244269-279. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2016.08.020

15. Wang M, Wu B, Tucker JD, Lu P, Lu Q. 2016. Poly(ester amine) constructed from polyethylenimine and pluronic for gene delivery in vitro and in vivo. Drug Delivery. 23(9):3224-3233. https://doi.org/10.3109/10717544.2016.1162877

16. Breunig M, Hozsa C, Lungwitz U, Watanabe K, Umeda I, Kato H, Goepferich A. 2008. Mechanistic investigation of poly(ethylene imine)-based siRNA delivery: Disulfide bonds boost intracellular release of the cargo. Journal of Controlled Release. 130(1):57-63. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2008.05.016

17. Neu M, Germershaus O, Mao S, Voigt K, Behe M, Kissel T. 2007. Crosslinked nanocarriers based upon poly(ethylene imine) for systemic plasmid delivery: In vitro characterization and in vivo studies in mice. Journal of Controlled Release. 118(3):370-380. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2007.01.007

18. Zhang L, Zhang Y, Chen Z, He Y. Intracellular redox-responsive nanocarrier for plasmid delivery: in vitro characterization and in vivo studies in mice. IJN. Volume 115245-5256. https://doi.org/10.2147/ijn.s94995

19. Dohmen C, Edinger D, Fröhlich T, Schreiner L, Lächelt U, Troiber C, Rädler J, Hadwiger P, Vornlocher H, Wagner E. 2012. Nanosized Multifunctional Polyplexes for Receptor-Mediated SiRNA Delivery. ACS Nano. 6(6):5198-5208. https://doi.org/10.1021/nn300960m

20. Wang M, Guo Y, Yu M, Ma PX, Mao C, Lei B. 2017. Photoluminescent and biodegradable polycitrate-polyethylene glycol-polyethyleneimine polymers as highly biocompatible and efficient vectors for bioimaging-guided siRNA and miRNA delivery. Acta Biomaterialia. 5469-80. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.02.034