Oligonukleotydy fosforotioanowe

Opracowano kilka wariantów szkieletu fosforanowego, próbując zmienić właściwości chemiczne DNA w stanie natywnym, a tym samym przezwyciężyć dwa główne wyzwania związane z wykorzystaniem oligonukleotydów in vivo, w tym: 1) dostarczanie do wnętrza komórki przez błonę plazmatyczną, dwuwarstwę lipidową, która bez białek transportowych jest w większości nieprzepuszczalna dla cząsteczek polarnych, oraz 2) wydłużenie efektywnego czasu życia cząsteczki poprzez zminimalizowanie dodatkowej i wewnątrzkomórkowej degradacji nukleazy.

Jednym z oryginalnych i wciąż najczęściej stosowanych wariantów szkieletu jest fosforotioan, powszechnie określany jako S-oligo, gdy jest włączony do oligonukleotydu (Rysunek 1). Stwierdzono, że fosforotioat pomaga złagodzić drugie główne wyzwanie związane ze stosowaniem oligonukleotydów in vivo poprzez zmniejszenie aktywności różnych nukleaz zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych¹.

Rysunek 1. Fosfodiestrowe i fosforotioanowe wiązania międzynukleotydowe. Cząsteczki cukru w oligonukleotydach DNA w stanie natywnym są połączone przez fosforan (zawiera niemostkujący tlen, zaznaczony niebieską strzałką), podczas gdy cząsteczki cukru w oligonukleotydach modyfikowanych odczynnikiem siarkującym są połączone przez fosforotioan (zawiera niemostkującą siarkę, zaznaczoną czerwoną strzałką).

Te cechy sprawiają, że fosforotioan jest skuteczny w tworzeniu oligonukleotydów do antysensownych knockdownów, jednej z wczesnych i wciąż poszukiwanych technologii terapeutycznych z użyciem kwasów nukleinowych². Oligonukleotydy fosforotioanowe obniżają ekspresję genów poprzez hybrydyzację z docelowym mRNA, co z kolei hamuje dojrzewanie mRNA, umożliwia degradację transkryptu za pośrednictwem RNazy H lub blokuje translację³.

Oprócz technologii in vivo, takich jak antysens, fosforotioan jest obecnie często stosowany w technologiach in vitro z podobnych powodów, tj. w celu zapobiegania degradacji nukleolitycznej. Na przykład oligonukleotydy adapterowe do sekwencjonowania nowej generacji są często modyfikowane na jednym 3'-końcowym wiązaniu międzynukleotydowym, aby zapobiec degradacji przez enzymy stosowane podczas przygotowywania biblioteki⁴.

Właściwości fizyczne

Podczas gdy fosforotioanowe wiązania międzynukleotydowe są odporne na działanie nukleaz, wprowadzenie zbyt wielu takich wiązań zmniejsza funkcjonalność oligonukleotydu, szczególnie w przypadku antysensu. Dzieje się tak, ponieważ proces siarkowania stosowany podczas syntezy tworzy stereogeniczne atomy α-fosforu (Rysunek 2), co skutkuje powstaniem diastereomerów (2ⁿ-1 konfiguracji dla oligonukleotydu o długości n). Te rodzaje stereoizomerów mają różne właściwości funkcjonalne, z których niektóre negatywnie wpływają na antysens. Potencjalny negatywny wpływ diastereomerów można jednak zminimalizować poprzez odpowiednie włączenie modyfikacji.

Rysunek 2. Stereogeniczny α-fosfor w jednym wiązaniu międzynukleotydowym. Przypadkowa konfiguracja R i S skutkuje powstaniem diastereomerów.

Wytyczne dotyczące inkorporacji

Ponieważ efekt modyfikacji wiązań międzynukleotydowych jest często nieprzewidywalny³, projektowanie skutecznych oligonukleotydów fosforotioanowych odpornych na degradację jest często procesem prób i błędów (Rysunek 3 dla przykładowego formatu sekwencji). Wiązania fosforotioanowe niekoniecznie muszą być obecne w całym oligonukleotydzie, ale należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:

        -  Aby być odpornym na egzonukleazy, oligonukleotyd powinien mieć wiązania fosforotioanowe zarówno w pobliżu końca 5', jak i 3'.br>        -  Aby być odpornym na endonukleazy, oligonukleotyd powinien mieć wiązania fosforotioanowe w całej sekwencji

Minimalna liczba inkorporacji - zwykle określana eksperymentalnie - powinna być stosowana w celu zapobiegania negatywnym skutkom związanym z mieszaniną diastereomeryczną, w tym: 1) interferencji z oligonukleotydem:termodynamika hybrydyzacji docelowej spowodowana niższą temperaturą topnienia (T_m) - wynika z przeszkody sterycznej niektórych konfiguracji, co zwiększa sztywność molekularną, oraz 2) wiązanie poza celem - nadmierne wiązania fosforotioanowe mogą powodować, że oligonukleotydy są "lepkie" - mogą prowadzić do fałszywych efektów antysensownych, a tym samym zwiększać prawdopodobieństwo toksyczności komórkowej.
 

                                                 ACGTACGTACGTACGTACGT             &A*C*G*TACGTACGTACGTA*C*G*T

                                              Oligonukleotyd fosfodiestrowy            nbsp;        Oligonukleotyd fosforotioestrowy

Rysunek 3. Przykładowe skrócone formaty sekwencji fosfodiestrowych i fosforotioanowych oligonukleotydów o tej samej sekwencji.  Fosforotioanowe wiązania międzynukleotydowe są oznaczone gwiazdkami. Jak widać, sekwencja ma minimalną liczbę inkorporacji i została zaprojektowana w celu ochrony przed hipotetyczną egzonukleazą.

Ponadto, w przypadku stosowania oligonukleotydów fosforotioanowych z modyfikacjami, ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że stechiometria reakcji może być zmniejszona, co z kolei prowadzi do niższej minimalnej wydajności niż w przypadku oligonukleotydów zawierających tylko fosforotioany (& nbsp;Standardowa synteza DNA.nbsp;Standardowa synteza DNA i Custom DNA Oligos Modifications dla minimalnych wydajności odpowiednio oligonukleotydów tylko fosforotioanowych i zmodyfikowanych fosforotioanowych).

Oczyszczanie

Oligonukleotydy fosforotioanowe można oczyszczać za pomocą HPLC, co jest korzystne, ponieważ są one często stosowane in vivo i dlatego muszą mieć najwyższą możliwą jednorodność, aby uniknąć efektów cytotoksycznych, wiązania poza celem itp. Jednak piki HPLC będą nieco szersze niż w przypadku oligonukleotydów fosfodiestrowych ze względu na większą skłonność oligonukleotydów fosforotioestrowych do tworzenia struktur drugorzędowych, a także do składania się z mieszaniny diastereomerycznej (Chromatography Profile Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides).

Wnioski

Fosforotiolany skutecznie zmniejszają nukleolityczną degradację oligonukleotydów potrzebnych zarówno w technologiach in vivo, jak i in vitro. Dostępnych jest kilka skal syntezy i oczyszczania, aby zaspokoić różnorodne potrzeby badawcze i stosowane. 

Referencje

1. Putney SD, Benkovic SJ, Schimmel PR. 1981. A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicated in vivo.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78(12):7350-7354. https://doi.org/10.1073/pnas.78.12.7350

2. Eckstein F. 2014. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 24(6):374-387. https://doi.org/10.1089/nat.2014.0506

3. Chan JH, Lim S, Wong WF. 2006. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(5-6):533-540. https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2006.04403.x

4. Shin J, Ming G, Song H. 2014. Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing. Nat Neurosci. 17(11):1463-1475. https://doi.org/10.1038/nn.3814