Ekstrakcja amfetaminy i powiązanych z nią narkotyków przy użyciu polimeru z nadrukiem molekularnym SPE

Christine Widstrand, Staffan Bergström, Anna-Karin Wihlborg¹, An Trinh²

¹MIP Technologies AB, Scheelevägen 22, 220 07, Lund, Sweden, ²Supelco, 595 North Harrison Road, Bellefonte, PA, 16823, USA

Reporter US Volume 26.1

an.trinh@sial.com

Wprowadzenie

Amfetamina i narkotyki związane z amfetaminą należą do klasy stymulantów i halucynogenów używanych przez studentów, sportowców i rekreacyjnych użytkowników narkotyków. W ciągu ostatnich 15 lat nadużywanie tych narkotyków stało się problemem globalnym. W 2004 r. w Stanach Zjednoczonych skonfiskowano ponad 17 000 laboratoriów metamfetaminy, w wyniku czego w 2006 r. podpisano ustawę z 2005 r. o zwalczaniu metamfetaminy (The Combat Methamphetamine Act of 2005) w celu uregulowania sprzedaży bez recepty efedryny, pseudoefedryny i fenylopropanolaminy, które są prekursorami wykorzystywanymi do nielegalnej produkcji amfetaminy i metamfetaminy (1). W raporcie z 2005 r. przeprowadzonym przez Europejskie Centrum Monitorowania Narkotyków i Narkomanii stwierdzono, że używanie amfetaminy i ecstacy rośnie w całej Europie (2). W ostatnich latach na rynku dostępne były różne techniki badań przesiewowych/wykrywania, takie jak ELISA i inne zestawy/urządzenia kolorymetryczne oparte na immunologii oraz zestawy/urządzenia POC (point of collection). Chociaż takie testy są szybkie i wydajne, wiele z nich zazwyczaj nie jest selektywnych klasowo i wykrywa tylko niektóre amfetaminy, a nie inne (3). Lub niektóre testy immunologiczne nie są wystarczająco selektywne i rozpoznają tak szeroki zakres amin sympatykomimetycznych, że dodatnia wartość predykcyjna (PPV) może wynosić od 0 do 90% (4). W obu przypadkach, aby zweryfikować wyniki badań przesiewowych opartych na testach immunologicznych, wymagany jest alternatywny i wysoce selektywny test potwierdzenia specyficzny dla danej klasy.

W niniejszym raporcie opisujemy prostą, szybką i selektywną metodę ekstrakcji śladowych ilości narkotyków związanych z amfetaminą z próbek moczu przy użyciu molekularnie wdrukowanego polimeru SPE (SupelMIP^™) specjalnie zaprojektowanego do selektywnej ekstrakcji narkotyków związanych z amfetaminą (Rysunek 1). Technika SupelMIP jest również porównywana z niedawno opublikowaną techniką ekstrakcji przy użyciu konwencjonalnej hydrofilowej polimerowej fazy SPE (5).

Rysunek 1. Badane struktury chemiczne amfetaminy i narkotyków pokrewnych

Polimery wdrukowywane molekularnie

Polimery wdrukowywane molekularnie (MIP) to klasa wysoce usieciowanych polimerowych elementów rozpoznawania molekularnego zaprojektowanych do wiązania jednego związku docelowego lub klasy strukturalnie powiązanych związków z wysoką selektywnością. Selektywność jest wprowadzana podczas syntezy MIP, w której cząsteczka szablonu, zaprojektowana tak, aby naśladować analit, kieruje tworzeniem określonych wnęk lub odcisków, które są sterycznie i chemicznie komplementarne do docelowego analitu (ów). W rezultacie między wnęką MIP a grupami funkcyjnymi analitu może zachodzić wiele interakcji (np. wiązanie wodorowe, jonowe, Van der Waalsa, hydrofobowe). Silna retencja oferowana między fazą MIP a jej docelowym analitem (analitami) pozwala na stosowanie wyczerpujących procedur płukania podczas ekstrakcji w fazie stałej, co skutkuje doskonałym oczyszczaniem próbki przed analizą.

Prowadzi to do czystszych ekstraktów, niższych limitów wykrywalności i bardziej wydajnego procesu oczyszczania próbki. Ilustrację wnęki selektywnej przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 2. Ilustracja selektywnej wnęki MIP

Ekstrakcja i analiza amfetaminy i narkotyków pokrewnych

Amfetaminę i narkotyki pokrewne: metamfetaminę, fenterminę, MDA, MDMA i MDEA ekstrahowano z moczu przy użyciu zarówno SPE SupelMIP, jak i konwencjonalnego hydrofilowego polimeru SPE zgodnie z procedurami opisanymi w Tabeli 1. Ekstrakty były dalej analizowane za pomocą LC-MS-MS (Tabela 2).

Tabela 1. Porównanie metody SupelMIP SPE - amfetaminy i konwencjonalnej metody SPE z polimerem hydrofilowym (53228-U)

SupelMIP SPE- Metoda Amfetaminowa	Publikowana metoda amfetaminy z wykorzystaniem konwencjonalnej hydrofilowej polimerowej fazy SPE (5)
Obróbka wstępna próbki	Obróbka wstępna próbki
Próbki moczu ludzkiego zostały wzbogacone wzorcem wewnętrznym (metamfetamina-d3i MDM A-d5) i rozcieńczone 1:1 (v/v) z 10 mM buforem octanu amonu, pH 8. Dostosować do pH 7,5-8,5 za pomocą NH lub HAc Procedura SPE	Próbki moczu ludzkiego zostały wzbogacone wzorcem wewnętrznym. Spikowany i ślepy mocz zakwaszono 100 µl 5 M HCI na 10 ml moczu. Procedura SPE
SupelMIP SPE - Amfetaminy, 25 mg/3 mL (53228-U) 1.Przygotować i wyrównać fazę MIP za pomocą 1 ml metanolu i 1 ml 10 mM buforu octanu amonu, pH 8 2. Załadować 1 mL wstępnie oczyszczonej próbki do wkładu. 3. Płukać (eluować interferencje) stosując następujący schemat płukania: - 2 x 1 mL wody DI (Nie dopuścić do wyschnięcia kolumny!) - 1 mL wody 60/40 MeCN/DI, a następnie 5-10 minut próżni (-1 bar, -20 inHg lub -70 kPA) w celu osuszenia kolumny - 1 mL 1% HAc w MeCN 4. Elucja amfetaminy za pomocą 2 x 1 ml 1% kwasu mrówkowego w metanolu. Zastosować - 0,4 bara (-12 in Hg) pomiędzy każdą frakcją. 5. Odparować pod azotem do sucha i odtworzyć w 150 µl fazy ruchomej LC (90% A i 10% B) przed analizą LC-MS-MS	Konwencjonalna hydrofilowa faza polimerowa SPE, 30 mg/1 mL 1.Przygotować i wyrównać fazę SPE za pomocą 1 mL metanolu i 1 mL wody DI 2. Załadować 1 mL wstępnie oczyszczonej próbki do wkładu. 3. Przemyć (usunąć zakłócenia) 1 ml 5% metanolu zawierającego 2% wodorotlenku amonu i 1 ml 20% metanolu zawierającego 2% wodorotlenku amonu 4. Elucja amfetaminy za pomocą 0,5 ml 20% metanolu z 2% kwasem octowym 5. Odparować pod azotem i ponownie dodać 150 µl fazy ruchomej LC przed analizą LC-MS-MS

Tabela 2. Warunki LC-MS-MS (581304-U)

Kolumna:	Ascentis C18, 15 cm x 2.1 mm, cząstki 5µm, (581304-U)
Instrument:	Shimadzu LC-20/Applied Biosystems/MDS SCIEX APl3200
Faza mobilna:	Rozpuszczalnik A - woda DI + 0.05% TFA Rozpuszczalnik B - Acetonitryl + 0.05% TFA
Gradient:	Initial: 90% A - 10% B 7 min 70% A - 30% B 10-11 min 10% A - 90% B 11.2 min 90% A - 10% B
Temp.		Czas otoczenia
Szybkość przepływu:	0.2 ml/min
Tryb jonowy:	Dodatni
Źródło jonów:	Turbospray
Ion Spray Voltage:	5500V
Temperatura źródła.	600 °C
Gaz kolizyjny:	6 psi
Inj.	20 µl
Det.	MS-MS
Czasy przejścia i retencji MRM:	Związek Amfetamina Metamfetamina Metamfetamina D8 Fentermina MDA MDMA MDMA D 6 MDEA	Rt (min) 7.8 8.3 8.3 8.7 8.0 8.5 8.5 9.2	Q1/Q3 136/119 i 136/91 1S0/119 i 1S0/91 1S8/124 i 1S8/93 1S0/133 i 1S0/91 180/163 i 180/10S 194/163 i 194/10S 199/16S i 199/136 208/163 i 108/105

Niższe granice oznaczalności uzyskane przy użyciu SupelMIP SPE

Narkotyki amfetaminowe wymienione na Rysunku 1<< /b> zostały wprowadzone do moczu na poziomie 15 ng/ml./zostały wprowadzone do moczu na poziomie 15 i 50 ng/ml i ekstrahowane/analizowane przy użyciu procedur opisanych w Tabeli 1 i Tabeli 2. Dolną granicę oznaczalności (LLOQ) dla każdego analitu oszacowano zarówno dla metody SupelMIP SPE, jak i konwencjonalnej metody hydrofilowej SPE (stosunek sygnału do szumu 10:1) i podsumowano w Tabeli 3. Stosując metodę SupelMIP, osiągnięto LLOQ w zakresie 2,5 - 43,0 pg/ml (o rząd wielkości niższe niż w przypadku konwencjonalnej metody hydrofilowego polimeru SPE). Aby dodatkowo zilustrować wysoką selektywność uzyskaną przy użyciu metody ekstrakcji SupelMIP SPE, mocz został wzbogacony amfetaminą o stężeniu 15 pg/ml i poddany ekstrakcji/analizie jak powyżej. Pik amfetaminy został łatwo wykryty przy użyciu metody ekstrakcji SupelMIP SPE. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano reakcji amfetaminy przy użyciu konwencjonalnej metody hydrofilowego polimeru SPE (Rysunek 3).

Tabela 3. LLOQ dla SupelMIP SPE vs. konwencjonalny polimer hydrofilowy SPE

	SupelMIP (pg/mL)	Konwencjonalny Hydrofilowy Polimer SPE (pg/mL)
Metamfetamina	6.6	52
Amfetamina	7.3	138
Fentermina	1.5	141
MDA	4.3	261
MDMA	3.0	56
MDEA	2.5	52

Rysunek 3. Próbki moczu z domieszką amfetaminy (15 pg/mL) oczyszczone za pomocą SPE SupelMIP w porównaniu z konwencjonalną SPE z polimerem hydrofilowym

Ulepszony odzysk & Zmniejszona supresja jonów osiągnięta przy użyciu SupelMIP SPE

Próbki moczu zostały wzbogacone narkotykami amfetaminowymi wymienionymi na Rysunku 1 na poziomach 0.010, 0,015, 0,50, 1,0 i 5,0 ng/ml i ekstrahowano/analizowano przy użyciu metod opisanych w Tabeli 1 i Tabeli 2. Względny odzysk dla każdego stężenia spike'a określono względem deuterowanych wzorców wewnętrznych. Osiągnięto ponad 80% względny odzysk dla wszystkich badanych poziomów spike (z wyjątkiem MDA) przy użyciu metody SupelMIP SPE. W przeciwieństwie do tego, 0% odzysku zaobserwowano dla wszystkich narkotyków amfetaminy przy poziomach spike 0,010 i 0,015 ng / ml, a przy poziomach spike 0,5, 1,0 i 5,0 ng / ml, odzysk powyżej 80% zaobserwowano tylko dla metamfetaminy i MDMA przy użyciu konwencjonalnej metody polimeru hydrofilowego (dane nie pokazane).

Puste próbki moczu oczyszczono zgodnie z obiema procedurami SPE. Ekstrakty SPE zostały wzbogacone mieszaniną leków amfetaminowych po ekstrakcji. Standardowe krzywe kalibracyjne zostały porównane z próbkami dopasowanymi do matrycy dla obu metod, bez użycia korekty standardu wewnętrznego. Tabela 4 podsumowuje procent tłumienia jonów przy 10 i 100 ng/ml dla metody SupelMIP SPE i hydrofilowego polimeru SPE. Z tabeli wynika, że tłumienie jonów jest znacznie mniejsze w przypadku SPE SupelMIP.

Tabela 4. % tłumienie jonów przez SPE SupelMIP vs. SPE z polimerem hydrofilowym

	SupelMIP (ng/mL)		Conventional Hydrophilic Polymer SPE (ng/mL)
	10	100	10	100.
Metamfetamina	0%	3%	31%	12%
Amfetamina	5%	10%	33%	28%
Fentermina	3%	2%	36%	22%
MDA	30%	23%	51%	48%
MDMA	5%	13%	45%	36%<
MDEA	10%	4%	65%	52%

Wnioski

W niniejszym raporcie zademonstrowaliśmy użyteczność metody molekularnie wdrukowanego polimeru SPE (SupelMIP) zaprojektowanej do selektywnej klasowo ekstrakcji amfetaminy i pokrewnych narkotyków z moczu. W porównaniu do niedawno opublikowanej konwencjonalnej metody SPE z hydrofilowym polimerem, metoda SupelMIP oferuje zmniejszoną supresję jonów i osiąga niższe LOQ / LOD o rząd wielkości. Wysoce selektywna metoda SupelMIP oferowała również zwiększony odzysk i odtwarzalność, zapewniając lepszą czułość, precyzję i dokładność.

Referencje

1. The Combat Meth Act of 2005. Available at: . http://www.deadiversion.usdoj. gov/meth/q_a

2. 2005. European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Available at: .. Annual Report . . http://www.emcdda.eu.int/

3. Walsh, Forensic Science International, 2007. In Press .

4. Woodworth A, Saunders AN, Koenig JW, Moyer TP, Turk J, Dietzen DJ. 2006. Differentiation of Amphetamine/Methamphetamine and Other Cross-Immunoreactive Sympathomimetic Amines in Urine Samples by Serial Dilution Testing. 52(4):743-746. https://doi.org/10.1373/clinchem.2005.060616

5. Fuh M, Wu T, Lin T. 2006. Determination of amphetamine and methamphetamine in urine by solid phase extraction and ion-pair liquid chromatography?electrospray?tandem mass spectrometry. Talanta. 68(3):987-991. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2005.06.057