Oznaczanie utleniania fosfolipidów za pomocą spektroskopii UV/VIS - Avanti^® Polar Lipids

Definicja

Procent utlenienia fosfolipidu można określić, stosując prawo Beera do obliczenia stężenia peroksydowanego fosfolipidu na podstawie jego absorbancji przy 234 nm.

Zakres

Zastosowanie do wszystkich nienasyconych fosfolipidów.

Aparatura

• Spektrofotometr UV/VIS
• HELLMA UV Quartz Sample Cell (QS 1.000)
• Chusteczki higieniczne
• Szklane probówki jednorazowego użytku

Odczynniki

• Etanol (200 proof, odwodniony USP)
• Woda dejonizowana
• 16:0 PC (DPPC)

Procedura

1. Przygotowanie próbki DPPC. Przygotuj co najmniej 3 ml roztworu DPPC o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonego w etanolu/wodzie utlenionej (9:1).
2. Przygotuj próbkę.Przygotuj co najmniej 3 ml roztworu próbki fosfolipidów o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonego w etanolu/wodzie DI (9:1).
3. Run the Blank. Ślepa próba (tło) jest rozpuszczalnikiem używanym do rozpuszczania próbek fosfolipidów.
   • Trzykrotnie przepłucz kuwetę z próbką rozpuszczalnikiem, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń z kuwety.
   • Wypełnij 3/4 kuwety z próbką wzorcową.
   • Użyj chusteczki Kimwipe, aby zetrzeć wszystkie odciski palców i zanieczyszczenia z zewnętrznej części kuwety z próbką.
   • Włóż kuwetę z próbką do spektrofotometru i uruchom puste widmo.
4. Uruchom próbkę DPPC.
   • Wylej pusty rozpuszczalnik z celi pomiarowej.
   • Wypełnij 3/4 celi pomiarowej roztworem próbki DPPC.
   • Usuń odciski palców z zewnętrznej części kuwety z próbką.
   • Włóż kuwetę z próbką do spektrofotometru i wykonaj widmo DPPC.
5. Run the Sample.
   • Wylej próbkę DPPC z kuwety.
   • Trzykrotnie przepłucz kuwetę z próbką rozpuszczalnikiem, aby usunąć wszelkie pozostałości DPPC z kuwety.
   • Wypełnij 3/4 kuwety z próbką fosfolipidów.
   • Usuń odciski palców z zewnętrznej części kuwety z próbką. Włóż kuwetę z próbką do spektrofotometru i uruchom widmo próbki.
   • Odejmij widmo DPPC od widma próbki i zapisz odczyt absorbancji próbki fosfolipidów (OD) przy 234 nm.

Obliczenia

Stężenie peroksydowanego lipidu (D) = A/(B*C)
A = Odczyt absorbancji (OD) przy 234 nm
B = Współczynnik ekstynkcji w (OD*mL)/(mmol*cm) (27,000 dla peroksydowanego lipidu)
C = Długość ścieżki w cm Procent utlenienia = D/E * 100
D = Stężenie peroksydowanego lipidu w mg/mL
E = Stężenie próbki lipidu = 1.0 mg/ml

Referencje

1. Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.