Przeprowadzanie separacji przy użyciu Sephadex^®

Odsalanie i wymiana buforu może trwać mniej niż 5 minut/próbkę z odzyskiem większym niż 95% dla większości białek.

Aby zapobiec możliwym interakcjom jonowym, zaleca się obecność niskiego stężenia soli (25 mM chlorku sodu) podczas odsalania i w buforze próbki końcowej. Bufory lotne, takie jak 100 mM octan amonu lub 100 mM wodorowęglan amonu mogą być stosowane, jeśli konieczne jest uniknięcie obecności chlorku sodu.

Próbka powinna być całkowicie rozpuszczona. Odwirować lub przefiltrować w celu usunięcia cząstek stałych (Appendix 3). Zawsze używaj odgazowanych buforów, aby uniknąć wprowadzenia powietrza do kolumny.

Stężenie próbki do 70 mg/ml białka nie powinno wpływać na rozdział przy użyciu zwykłych buforów wodnych.

Jeśli to możliwe, użyj systemu chromatograficznego z monitorem UV i przewodności, aby ułatwić optymalizację obciążenia próbki. Elucję piku białka przy A₂₈₀ i pojawienie się piku soli można dokładnie śledzić, a różne separacje można łatwo porównać, jak pokazano na Rysunku 5.6.

Jeśli przewodność nie może być monitorowana, a odzysk całkowicie odsolonej próbki jest głównym wymaganiem, należy zastosować objętość próbki od 15% do 20% całkowitej objętości kolumny.

Rysunek 5.6. Wymiana buforu osocza myszy w procesie odsalania HiPrep™ 26/10.

Uwagi ogólne

Odsalanie próbek na małą skalę

W przypadku próbek o objętości od 0,2 do 2,5 ml możliwe jest równoległe przetwarzanie wielu próbek za pomocą kolumn PD-10 Desalting, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25. Dla tych kolumn dostępne są dwa różne protokoły: jeden do użytku ręcznego na stanowisku laboratoryjnym, a drugi do użytku wraz ze standardową wirówką w połączeniu z adapterem Spin. W przypadku mniejszych białek (M_r > 700) można użyć kolumn PD MiniTrap™ G-10 i PD MidiTrap™ G-10.

W przypadku mniejszych objętości próbek w zakresie od 70 do 130 μL, wiele próbek można przeprowadzić na kolumnach wirówkowych PD SpinTrap™ G-25 wraz z mikrowirówką lub na płytce 96-dołkowej PD MultiTrap™ G-25 przy użyciu wirowania do ekstrakcji. Chociaż jest to możliwe, nie zaleca się stosowania PD MultiTrap™ G-25 z próżnią ze względu na zmniejszoną odtwarzalność w porównaniu z operacją wirowania.

Odsalanie większych objętości próbek przy użyciu kolumn HiTrap^® i HiPrep™

Połącz szeregowo do trzech kolumn odsalających HiTrap^® w celu zwiększenia pojemności próbki. Na przykład dwie kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 3 ml, a trzy kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 4,5 ml.

Podłącz szeregowo do czterech kolumn odsalających HiPrep™ 26/10, aby zwiększyć pojemność próbki. Na przykład, dwie kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 30 ml, a cztery kolumny pozwalają na uzyskanie próbki o objętości 60 ml. Nawet z czterema kolumnami w szeregu, próbka może być przetworzona w ciągu 20 do 30 minut bez problemów z przeciwciśnieniem.

Przygotowanie buforu

Dla substancji zawierających grupy naładowane, zalecany jest eluent zawierający sól buforową. Zalecane jest stężenie soli wynoszące co najmniej 150 mM, aby zapobiec możliwym interakcjom jonowym z medium chromatograficznym. W tym celu często stosuje się chlorek sodu. Często wystarczający jest bufor o stężeniu substancji buforującej od 25 do 50 mM. Przy stężeniach soli powyżej 1 M, substancje hydrofobowe mogą być opóźnione lub mogą wiązać się z medium chromatograficznym.

Przy jeszcze wyższych stężeniach soli, 1,5 M siarczanu amonu, wypełnienie kolumny kurczy się.

Przygotowanie próbki

Stężenie próbki nie ma wpływu na separację, o ile lepkość nie różni się więcej niż o współczynnik 1,5 od zastosowanego buforu. Odpowiada to maksymalnemu stężeniu 70 mg/ml dla białek, gdy stosowane są normalne, wodne bufory. Próbka powinna być w pełni rozpuszczona. Odwiruj lub przefiltruj (filtr 0,45 μM) bezpośrednio przed załadowaniem, aby usunąć cząstki stałe, jeśli to konieczne.

Wymiana buforu

Rozpuszczalność białka często zależy od pH i/lub siły jonowej (stężenia soli), a wymiana buforu może zatem spowodować wytrącenie białka. Aktywność białka może również zostać utracona, jeśli zmiana pH wykracza poza zakres, w którym białko jest aktywne. Próbki uzyskane po oczyszczeniu będą zwykle wolne od cząstek, chyba że oczyszczone białko lub zanieczyszczenie uległo agregacji.

Protokoły w poniższych sekcjach opisują odsalanie i wymianę buforu przy użyciu różnych formatów kolumn wstępnie zapakowanych.

HiTrap^® Kolumny do odsalania

Rysunek 5.7. Kolumna odsalająca HiTrap® umożliwia łatwe i wydajne rozdzielanie grup za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego.

HiTrap^® Desalting to kolumna o pojemności 5 ml (Rysunek 5.7) wypełniona podłożem SEC Sephadex G-25 Superfine, opartym na usieciowanych kulkach dekstranowych. Zakres frakcjonowania białek globularnych wynosi od M_r 1000 do 5000, z granicą wykluczenia około M_r 5000. Zapewnia to grupowe oddzielanie białek/peptydów większych niż Mr 5000 od cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż M_r 1000.

HiTrap^® Desalting może być stosowany z roztworami wodnymi w zakresie pH od 2 do 13. Zapakowany nośnik jest stabilny we wszystkich powszechnie stosowanych buforach, roztworach mocznika (8 M), chlorowodorku guanidyny (6 M) oraz wszystkich niejonowych i jonowych detergentach. Niższe alkohole (metanol, etanol, propanol) mogą być stosowane w buforze lub próbce, ale zalecamy, aby ich stężenie nie przekraczało 25% v/v. Należy unikać długotrwałej ekspozycji (godziny) na pH poniżej 2 lub powyżej 13 lub na środki utleniające.

Zalecany zakres objętości próbek wynosi od 0,1 do 1,5 ml, gdy pożądane jest całkowite usunięcie składników o niskiej masie cząsteczkowej. Szybkość przepływu w zakresie od 1 do 10 ml/min nie ma wpływu na separację. Maksymalne zalecane natężenie przepływu wynosi 15 ml/min. Separację można łatwo przeprowadzić za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego. Maksymalnie trzy kolumny mogą być połączone szeregowo, co pozwala na obsługę większych objętości próbek. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, kolumny należy używać tylko z tym samym typem próbki.

Ręczne oczyszczanie za pomocą strzykawki

Rysunek 5.8. Używanie kolumn HiTrap® ze strzykawką. (A) Przygotuj bufory i próbkę. Zdejmij górną nasadkę kolumny i odkręć jej koniec. (B) Wyrównaj kolumnę, załaduj próbkę i rozpocznij zbieranie frakcji. (C) Przemyć i eluować, kontynuując zbieranie frakcji.

1. Napełnić strzykawkę buforem wiążącym. Zdejmij zatyczkę i podłącz kolumnę do strzykawki (użyj dołączonego złącza) "kropla do kropli", aby uniknąć wprowadzenia powietrza do kolumny.
2. Usuń zatrzask na wylocie kolumny
3. Wyrównaj kolumnę za pomocą 5 objętości buforu wiążącego.
4. Nałóż wstępnie przygotowaną próbkę za pomocą strzykawki podłączonej do złącza Luer na kolumnie. Aby uzyskać optymalne wyniki, należy stosować szybkość przepływu od 0,2 do 1 ml/min (kolumna 1 ml) i od 0,5 do 5 ml/min (kolumna 5 ml) podczas nakładania próbki*.
5. Płukać 5 do 10 objętościami buforu wiążącego lub do momentu, gdy w roztworze nie pojawi się żaden materiał. Utrzymywać szybkość przepływu od 1 do 2 ml/min (kolumna 1 ml) i od 5 do 10 ml/min (kolumna 5 ml) do płukania. Opcjonalnie: zebrać przepływ (we frakcjach 1 ml dla kolumny 1 ml i 2 ml dla kolumny 5 ml) i zachować do pomyślnego zakończenia procedury. Zachować próbkę do analizy za pomocą SDS-PAGE w celu zmierzenia skuteczności wiązania białka z podłożem.
6. Elutować za pomocą 5 do 10 objętości buforu elucyjnego. Utrzymuj szybkość przepływu od 0,2 do 1 ml/min (kolumna 1 ml) i od 0,5 do 5 ml/min (kolumna 5 ml) do elucji.
7. Po elucji zregeneruj kolumnę, przemywając ją 3 do 5 objętościami buforu wiążącego. Kolumna jest teraz gotowa do nowego oczyszczania.

* 1 ml/min odpowiada około 30 kroplom/min przy użyciu strzykawki z kolumną HiTrap^® 1 ml; 5 ml/min odpowiada około 120 kroplom/min przy użyciu kolumny HiTrap^® 5 ml.

W przypadku dużych objętości próbek, do podawania próbek i buforów można użyć pompy perystaltycznej.