Przygotowanie próbki do chromatografii wykluczania wielkością

Próbki do oczyszczania chromatograficznego powinny być czyste i wolne od cząstek stałych. Proste kroki w celu oczyszczenia próbki przed rozpoczęciem oczyszczania pozwolą uniknąć zatykania kolumny, mogą zmniejszyć potrzebę rygorystycznych procedur płukania i mogą wydłużyć żywotność medium chromatograficznego.

Procedury ekstrakcji próbek i wybór buforów, dodatków i detergentów są w dużej mierze określane przez źródło materiału, stabilność cząsteczki docelowej, techniki chromatograficzne, które zostaną zastosowane, oraz zamierzone zastosowanie produktu. Tematy te zostały omówione w sposób ogólny w Podręczniku oczyszczania białek, a bardziej szczegółowo w zależności od cząsteczki docelowej w Podręczniku białek rekombinowanych i Podręczniku oczyszczania przeciwciał, dostępnych w firmie Cytiva.

Oczyszczanie próbek

Wirowanie i filtracja są standardowymi technikami laboratoryjnymi służącymi do oczyszczania próbek i są rutynowo stosowane podczas pracy z małymi próbkami.

Zaleca się odwirowanie i przefiltrowanie każdej próbki bezpośrednio przed oczyszczaniem chromatograficznym.

Wirowanie

Wirowanie usuwa lipidy i cząstki stałe, takie jak resztki komórek. Jeśli po odwirowaniu próbka nadal nie jest klarowna, użyj bibuły filtracyjnej lub filtra 5 μm jako pierwszego etapu i jednego z poniższych filtrów jako filtra drugiego etapu.

• W przypadku małych objętości próbek lub białek, które adsorbują się na filtrach, odwiruj przy 10 000 × g przez 15 min.
• W przypadku lizatów komórkowych odwiruj przy 40 000 do 50 000 × g przez 30 min.
• Próbki surowicy można przefiltrować przez watę szklaną po odwirowaniu, aby usunąć wszelkie pozostałe lipidy.

Filtracja

Filtracja usuwa cząstki stałe. Filtry membranowe, które zapewniają najmniejszą ilość niespecyficznego wiązania białek, składają się z octanu celulozy lub PVDF.

Do przygotowania próbki przed chromatografią należy wybrać rozmiar porów filtra w stosunku do rozmiaru kulek medium chromatograficznego (Tabela A3.1).

W przypadku filtrów membranowych, należy wybrać rozmiar porów filtra w stosunku do rozmiaru kulek medium chromatograficznego (Tabela A3.1).

Tabela A3.1 Zalecenia dotyczące wielkości porów filtra

Nominalna wielkość porów filtra	Rozmiar cząstek medium chromatograficznego
1 μm	90 μm wzwyż
0.
1 μm	90 μm i więcej
0.45 μm	34 μm
0.22 μm	3, 10, 15 μm lub gdy wymagane są wyjątkowo czyste próbki lub sterylna filtracja

Sprawdź odzysk białka docelowego w przebiegu testowym. Niektóre białka mogą adsorbować się niespecyficznie na powierzchniach filtrów.

Desalt

Denaturacja

.

Tabela A3.2 Powszechnie stosowane środki denaturujące

Środek denaturujący	Typowe warunki stosowania	Usuwanie/komentarz
Mocznik	2 do 6 M	Usuwać przy użyciu Sephadex G-25
Chlorowodorek guanidyny	3 do 6 M	Usuń używając Sephadex G-25

Szczegóły zaczerpnięto z: Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998) i innych źródeł.

Precypitacja i solubilizacja

Specyficzne etapy przygotowania próbki mogą być wymagane, jeśli wiadomo, że surowa próbka zawiera zanieczyszczenia, takie jak lipidy, lipoproteiny lub czerwień fenolowa, które mogą gromadzić się na kolumnie. Przygotowanie próbki może być również wymagane, jeśli pewne duże zanieczyszczenia, takie jak białka luzem, muszą zostać usunięte przed jakimkolwiek etapem chromatograficznym.

Frakcyjne wytrącanie jest czasami stosowane w skali laboratoryjnej w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń, ale generalnie nie jest wymagane w oczyszczaniu białek znakowanych powinowactwem. W niektórych przypadkach precypitacja może być przydatna jako połączony etap zatężania i oczyszczania białek.

Techniki precypitacji oddzielają frakcje na zasadzie zróżnicowanej rozpuszczalności. Na przykład, ponieważ gatunki białek różnią się stopniem hydrofobowości, zwiększone stężenie soli może wzmocnić oddziaływania hydrofobowe między białkami i spowodować wytrącanie. Wytrącanie frakcyjne może być stosowane do usuwania dużych zanieczyszczeń na trzy różne sposoby, jak pokazano na Rysunku A3.1.

Rysunek A3.1. Trzy sposoby wykorzystania wytrącania.

Na techniki wytrącania może mieć wpływ temperatura, pH i stężenie próbki.

Parametry te muszą być kontrolowane, aby zapewnić powtarzalne wyniki.
Większość technik wytrącania nie nadaje się do przygotowania na dużą skalę.

W przypadku wytrącania na dużą skalę, parametry te muszą być kontrolowane.

Tabela A3.3 Przykłady technik wytrącania

Odczynnik strącający	Typowe warunki stosowania	Rodzaj próbki	Uwaga
Siarczan amonu	Opisano poniżej.Typ próbki	Komentarz
Siarczan amonu	Jak opisano poniżej.	> 1 mg/ml białek, zwłaszcza immunoglobulin.	Stabilizuje białka, bez denaturacji; supernatant może być bezpośrednio przeniesiony do HIC. Pomaga zmniejszyć zawartość lipidów.
Siarczan dekstranu	Dodaj 0.04 ml 10% siarczanu dekstranu i 1 ml 1 M CaCl2 na ml próbki, mieszać 15 minut, odwirować przy 10 000 × g, odrzucić osad.	Próbki z wysokim poziomem lipoprotein, np, wodobrzusze.	Precypituje lipoproteiny.
Poliwinylopirolidyna	Dodaj 3% (w/v), mieszaj 4 h, odwiruj przy 17 000 × g, odrzuć osad.	Próbki z wysokim poziomem lipoprotein, np, wodobrzusze.	Alternatywa dla siarczanu dekstranu.
Glikol polietylenowy (PEG, Mr > 4000)	Do 20% (w/v).	Białka osocza.	Bez denaturacji, supernatant trafia bezpośrednio do IEX lub AC, całkowite usunięcie może być trudne. Stabilizuje białka.
Aceton (zimny)	Do 80% (v/v) w 0 °C.	Zebrać osad po odwirowaniu z pełną prędkością w mikrowirówce.	Może nieodwracalnie denaturować białko. Przydatny do wytrącania peptydów lub zatężania próbki do elektroforezy.
Polietylenoimina	0,1% (w/v).		Wytrąca zagregowane nukleoproteiny.
Siarczan protaminy	1% (w/v).		Precypituje zagregowane nukleoproteiny.
Siarczan streptomycyny	1% (w/v).		Precypituje kwasy nukleinowe.
Kwas kaprylowy	(X/15) g, gdzie X = objętość próbki.	Stężenie przeciwciał powinno wynosić > 1 mg/ml.	Precypituje większość białek z surowicy lub wodobrzusza, pozostawiając immunoglobuliny w roztworze.

Szczegóły zaczerpnięte z: Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998).

Wytrącanie siarczanem amonu

Wytrącanie siarczanem amonu jest często stosowane do wstępnego zatężania i oczyszczania próbek. Wraz ze wzrostem stężenia soli, białka zaczną się "wysalać". Różne białka wysalają się w różnych stężeniach, a proces ten można wykorzystać do usunięcia zanieczyszczających białek z surowego ekstraktu. Stężenie soli należy zoptymalizować w celu usunięcia zanieczyszczeń, a nie pożądanego białka. Dodatkowy etap ze zwiększonym stężeniem soli powinien następnie wytrącić docelowe białko. Jeśli docelowe białko nie może być bezpiecznie wytrącone i ponownie rozpuszczone, należy zastosować tylko pierwszy etap. HIC jest często doskonałym kolejnym etapem oczyszczania, ponieważ próbka zawiera już wysokie stężenie soli i może być stosowana bezpośrednio na kolumnie HIC przy niewielkim lub żadnym dodatkowym przygotowaniu. Podwyższony poziom soli zwiększa interakcję między hydrofobowymi składnikami próbki a medium chromatograficznym.

Roztwory potrzebne do wytrącania:

• Nasycony roztwór siarczanu amonu (dodać 100 g siarczanu amonu do 100 ml wody destylowanej, mieszać do rozpuszczenia).
• 1 M Tris-HCl, pH 8.0.
• Bufor do pierwszego etapu oczyszczania.

Niektóre białka mogą zostać uszkodzone przez siarczan amonu. Należy zachować ostrożność podczas dodawania krystalicznego siarczanu amonu: wysokie lokalne stężenia mogą spowodować zanieczyszczenie osadu niepożądanymi białkami.

Dla rutynowego, powtarzalnego oczyszczania należy unikać wytrącania za pomocą siarczanu amonu na korzyść chromatografii.

Ogólnie rzecz biorąc, wytrącanie rzadko jest skuteczne w przypadku stężeń białka poniżej 1 mg/ml.

1. Filtr (0.45 μm) lub odwiruj próbkę (10 000 × g w 4 °C).
2. Dodaj 1 część 1 M Tris-HCl, pH 8,0 do 10 części objętości próbki, aby utrzymać pH.
3. Delikatnie wymieszaj. Dodaj roztwór siarczanu amonu, kropla po kropli. Dodać do 50% nasycenia*. Mieszać przez 1 godzinę.
4. Wirować przez 20 minut z prędkością 10 000 × g.
5. Usuń supernatant. Przemyć osad dwukrotnie przez ponowne zawieszenie w równej objętości roztworu siarczanu amonu o tym samym stężeniu (tj. roztworu, który nie rozpuści ponownie wytrąconego białka ani nie spowoduje dalszego wytrącania). Ponownie odwirować.
6. Rozpuścić osad w niewielkiej objętości buforu, który ma być użyty w następnym kroku.
7. Siarczan amonu jest usuwany podczas etapów klarowania/wymiany buforowej z Sephadex G-25 przy użyciu kolumn odsalających (patrz Rozdział 5).

*Procentowe nasycenie może być regulowane w celu wytrącenia docelowej cząsteczki lub wytrącenia zanieczyszczeń.

Ilość siarczanu amonu wymagana do osiągnięcia danego stopnia nasycenia różni się w zależności od temperatury. Tabela A3.4 pokazuje ilości wymagane w temperaturze 20 °C.

Tabela A3.4 Ilości siarczanu amonu wymagane do osiągnięcia danego stopnia nasycenia w temperaturze 20 °C

Ostateczne procentowe nasycenie do uzyskania+A1:R23
	20	25	30	35	40	45	50	50	55	60	65	70	75	80	85	90	95	100
Procent początkowy	Ilość siarczanu amonu do dodania (w gramach) na litr roztworu w temperaturze 20 °C
0	113	144	176	208	242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	708	761
5	85	115	146	179	212	246	282	319	358	397	439	481	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	119	151	185	219	255	293	331	371	413	456	501	548	596	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	421	465	511	559	609
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	485	533
35			.	0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	358	402	447	495
40					0	31	63	96	130	166	202	241	281	322	365	410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	245	286	329	373	419
50							0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55			.					0	33	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	219	261	305
65										0	34	69	105	143	183	224	267
70											0	34	70	107	146	186	228
75												0	35	72	110	149	190
80													0	36	73	112	152
85														0	37	75	114
90															0	37	76
95																0	38

Usuwanie lipoprotein

Lipoproteiny i inny materiał lipidowy mogą szybko zatykać kolumny chromatograficzne i zaleca się ich usunięcie przed rozpoczęciem oczyszczania. Środki strącające, takie jak siarczan dekstranu i poliwinylopirolidyna, opisane w części Strącanie frakcyjne, są zalecane do usuwania wysokich poziomów lipoprotein z próbek takich jak płyn puchlinowy.

Próbki należy odwirować, aby uniknąć ryzyka niespecyficznego wiązania cząsteczki docelowej z filtrem.

Próbki takie jak surowica można przefiltrować przez watę szklaną w celu usunięcia pozostałych lipidów.

Próbki takie jak płyn puchlinowy można przefiltrować przez watę szklaną w celu usunięcia pozostałych lipidów.