Rozerwanie komórek i przygotowanie membran

Metody rozrywania komórek są zależne od gospodarza i zasadniczo te same protokoły są stosowane do odzyskiwania białek błonowych, jak w przypadku białek rozpuszczalnych w wodzie. Rozerwanie komórek daje zawiesinę fragmentów błony/pęcherzyków, która zawiera białka błonowe. Zawiesina zawiera również rozpuszczalne białka, pozostałe nienaruszone komórki, różne szczątki komórkowe i inny materiał jako zanieczyszczenia. Zanieczyszczenia te mogą wymagać usunięcia, w zależności od zastosowanej procedury oczyszczania. Wirowanie różnicowe jest standardowym podejściem do izolacji fragmentów błon/pęcherzyków po rozerwaniu komórek.

Peellet ze zbioru komórek jest ponownie zawieszany w odpowiednim buforze do rozerwania komórek (np. PBS). DNaza jest dodawana w celu zmniejszenia lepkości. Przydatne jest dodanie koktajlu inhibitorów proteazy w celu zmniejszenia możliwej degradacji białek. Wybór powszechnie stosowanych technik rozrywania komórek podsumowano w Tabeli 1.2.

Tabela 1.2 Przegląd technik rozbijania komórek w celu uzyskania zawiesiny pęcherzyków błonowych

Technika	Zasada	Zalety (+) / Wady (-)
Ciśnienie ścinania cieczy (np.g., Prasa francuska)	Szybki spadek ciśnienia poprzez przeniesienie próbki z komory pod wysokim ciśnieniem przez otwór do komory pod niskim ciśnieniem	+ Szybka i wydajna, również dla dużych objętości - Powoduje ogrzewanie próbki (wymagane jest chłodzenie)
Ultrasonikacja	Komórki zakłócone dźwiękiem o wysokiej częstotliwości	+ Proste - Powoduje podgrzanie próbki, co może być trudne do kontrolowania przez chłodzenie - Białka mogą zostać zniszczone przez ścinanie - Głośne - Nie dla dużych objętości
Frezowanie szklanych kulek	Agitacja komórek za pomocą drobnych szklanych kulek	+ Przydatne dla komórek, które są trudniejsze do rozbicia (np.g., drożdże) - nieco powolne i hałaśliwe
Szok osmotyczny	Zmiana ze środowiska o wysokiej do niskiej osmotyczności	+ Proste, niedrogie - Przydatne tylko do niszczenia komórek o mniej wytrzymałych ścianach (np.g., komórki zwierzęce)
Powtarzane zamrażanie i rozmrażanie	Komórki zakłócone przez powtarzające się tworzenie kryształków lodu; zwykle połączone z enzymatyczną lizą	+ Prosta, niedroga + Daje duże fragmenty błon - Powolna - Może uszkadzać wrażliwe białka i dysocjować kompleksy białek błonowych - Niska wydajność
Liza enzymatyczna	Często stosowana w połączeniu z innymi technikami, np.g., zamrażanie lub szok osmotyczny; lizozym jest powszechnie stosowany do rozbijania ścian komórkowych bakterii	+ Delikatna + Daje duże fragmenty błon - Powolna - Niska wydajność

 

Rozpad komórek z zamrożonych E. coli Pasta komórkowa z nadekspresją białka błonowego

Rozwiązania

PBS:	10 mM fosforan, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
MgCl2:	1 M
PefablocTM:	100 mM
DNase:	20 mg/ml
Lizozym:	10 mg/ml

Rozbijanie komórek

1. Na każdy gram pasty komórkowej połącz, z powyższych roztworów, 5 ml PBS, 5 µL MgCl₂, 50 µL Pefabloc, 5 µL DNazy i 80 µL lizozymu. Mieszać do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
2. Sonikowanie na lodzie. Użyj zalecanych przez producenta ustawień amplitudy i czasu dla używanej sondy (np, 5 minut skumulowanego czasu; 9 s włączenia, 5 s wyłączenia).
3. Natychmiast kontynuuj przygotowanie membrany.

Przygotowanie membrany powinno być wykonane natychmiast po rozerwaniu komórek.

 

Przygotowanie błony z E. coli.

Wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze 4 °C lub na lodzie.

1. Wirować przy 24 000 × g przez 12 min. Zebrać supernatant.
2. Wirować supernatant z prędkością 150 000 × g przez 45 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml PBS. Osad zawiera frakcję membranową.
3. Wirować ponownie zawieszony osad przy 150 000 × g przez 45 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS.
4. Określić stężenie białka przy użyciu standardowych metod dla białek rozpuszczalnych, takich jak metoda Biureta lub metoda kwasu bicinchoninowego (BCA).
5. W celu przechowywania, szybko zamrozić zawiesinę błony kroplami przy użyciu ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Różne protokoły rozbijania komórek mogą powodować powstawanie fragmentów o różnej wielkości; prędkość wirowania musi być odpowiednio zoptymalizowana.

Kryształy wody powstałe podczas powolnego zamrażania mogą uszkodzić białka błonowe. Szybkie zamrażanie poprzez zanurzenie zawiesiny membranowej w ciekłym azocie tworzy amorficzne struktury lodu, zmniejszając w ten sposób negatywne skutki zamrażania (niektórzy badacze unikają całkowitego zamrażania i zawsze wykonują przygotowanie białek membranowych od komórki do czystego białka tak szybko, jak to możliwe, bez przerw; patrz następny punkt).

W przypadku niestabilnych białek membranowych korzystne może być bezpośrednie oczyszczenie po przygotowaniu membran, a tym samym uniknięcie zamrażania i przechowywania membran.

W przypadku preparatów membranowych na małą skalę (0,5 do 50 ml) z E. coli, często skuteczna jest procedura z obróbką lizozymem, a następnie szokiem osmotycznym i wirowaniem.

Aby ułatwić oczyszczanie białek, przydatne może być oddzielenie błony wewnętrznej i zewnętrznej od E. coli preparatów błonowych. Może to być szczególnie pomocne w przypadku dużych (od 1 do 10 l) preparatów. Błonę wewnętrzną można selektywnie rozpuszczać za pomocą 2% N-lauroilosarkozyny. Zewnętrzne błony można następnie odzyskać w osadzie po 1-godzinnym wirowaniu. Alternatywą jest oddzielenie wewnętrznej i zewnętrznej błony przez długie (~10 godzin) wirowanie w gradiencie sacharozy, po rozerwaniu komórek.

Czasem możliwe jest pominięcie dość długiego i uciążliwego etapu przygotowania błony. Alternatywą jest najpierw rozbicie komórek, a następnie bezpośrednia solubilizacja białek błonowych poprzez dodanie detergentu do lizatu komórkowego, bez wcześniejszej izolacji błon. Uzyskany "solubilizat" może być bezpośrednio wykorzystany do chromatografii. Używając kolumn chromatograficznych, które akceptują bezpośrednie ładowanie nieklarowanego homogenizowanego lizatu komórkowego i nieklarowanego lizatu poddanego działaniu detergentu (np. surowe kolumny HisTrapTM FF), białka błonowe znakowane histydyną mogą być oczyszczane bezpośrednio z lizatu komórkowego.