Testy pull-down

Testy pull-down obejmują izolację kompleksu białkowego poprzez adsorpcję kompleksu na kulkach. Unieruchomione ligandy na kulkach wiążą się specyficznie ze składnikiem kompleksu, albo poprzez znacznik przynależności (np. GST, histydyna, białko wiążące maltozę itp.) lub przeciwciało. Testy pull-down są często stosowane do izolacji małych ilości µg kompleksów, głównie w celu identyfikacji poszczególnych podjednostek. Zostały one również wykorzystane do izolacji materiału do ograniczonych badań funkcjonalnych, ale inne metody wydają się bardziej odpowiednie do produkcji większych (mg) ilości. Składniki wychwyconego kompleksu są często ostatecznie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu identyfikacji podjednostek.

Testy pull-down są ważnymi narzędziami do mapowania sieci interakcji białko-białko. Zostały one z powodzeniem wykorzystane na skalę globalną do mapowania interakcji białko-białko w wielu organizmach (np. drożdże, E. coli, C. elegans). Podejścia genetyczne obejmujące system drożdżowo-dwuhybrydowy (Y2H) i podobne technologie są użytecznym uzupełnieniem izolacji kompleksów wielobiałkowych. Fałszywie dodatnie wyniki są głównym problemem związanym z mapowaniem interakcji białko-białko w skali globalnej. Dlatego też, oprócz odpowiednich eksperymentów kontrolnych, przydatne jest przeprowadzenie zarówno izolacji kompleksów, jak i eksperymentów Y2H niezależnie w celu walidacji zestawów danych. Po tym może nastąpić weryfikacja w środowisku bardziej podobnym do żywego.

Ta sekcja obejmuje trzy różne metody pull-down do izolowania niewielkich ilości kompleksów w celu identyfikacji składników kompleksu. Dwie z tych metod polegają na znakowaniu przynależności jednego (znanego lub domniemanego) składnika kompleksu. Trzecia metoda, koimmunoprecypitacja, obejmuje użycie przeciwciała skierowanego przeciwko jednemu (znanemu lub podejrzewanemu) składnikowi. Wszystkie trzy metody wykorzystują kulki z odpowiednimi ligandami w celu ściągnięcia kompleksu z surowej próbki biologicznej. Przegląd zalet i wad różnych metod przedstawiono w Tabeli 2.1.

.

Tabela 2.1Zalety i wady różnych testów pull-down do odzyskiwania kompleksów białkowych

Metoda	Zalety	Wady
Rozwijana lista zdolności	Ogólna zdolność do oczyszczania kompleksów białkowych o niskiej liczebności	Obecność znacznika białkowego może wpływać na wyniki Konkurencja z kompleksem endogennym
Tandemowa afirmacja oczyszczania (TAP)	Generic Zdolność do oczyszczania kompleksów białkowych o niskiej liczebności Łagodne warunki stosowane przez cały czas	Obecność znacznika białkowego może wpływać na wyniki Konkurencja z endogennym kompleksem
Co-immunoprecypitacja	Nie wymaga klonowania i heterologicznej ekspresji. Szybka jeśli przeciwciało jest dostępne	Nie generyczna - wymaga dostępu do specyficznych przeciwciał

Affinity pull-down assay

Affinity pull-down assay are well established for the isolation and subsequent identification of protein complexes. Testy GST pull-down obejmują oczyszczanie w sposób afityczny jednego lub kilku nieznanych białek z próbki biologicznej przy użyciu białka przynęty znakowanego GST. Podstawową zasadą jest to, że białko przynęty znakowane GST wiąże się ze swoimi partnerami, a powstały kompleks jest wychwytywany na kulkach z unieruchomionym glutationem. Kontrola jest dołączona w celu identyfikacji wyników fałszywie dodatnich, które wiążą się z GST przy braku białka przynęty. Kontrolą może być lizat z oddzielnie transformowanych komórek, które wyrażają GST (nie białko fuzyjne przynęty) lub lizat z nietransformowanych komórek, do których dodano GST. Zaprojektowanie odpowiednich kontroli dla eksperymentu jest niezbędne.

Powszechnym formatem testu jest odwirowanie kulek i związanych białek za pomocą wirówki, stąd termin "pull-down". Zasadę pokazano na Rysunku 2.4.

.

Rysunek 2.4. Zarys eksperymentu GST pull-down. Procedura po prawej stronie przedstawia eksperyment kontrolny. W tym przykładzie dwa białka (fioletowe i czerwone) zostały zidentyfikowane przez SDS-PAGE jako partnerzy interakcji z białkiem przynęty (lewy pas). Jedno dodatkowe białko (zielone) zostało ściągnięte, ale zidentyfikowane jako fałszywie dodatnie (wiązanie GST) przez kontrolę (prawy pas).

Test ściągania GST przy użyciu modułu oczyszczania GST SpinTrap

Materiały

Moduł oczyszczania GST SpinTrapzawierający 10× PBS, kolumny MicroSpin, bufor do rozcieńczania i zredukowany glutation

Przygotowanie buforu

1× PBS: Aby przygotować 1× PBS, rozcieńczyć dostarczony 10× PBS dziesięciokrotnie sterylną wodą. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Końcowe stężenie będzie wynosić 10 mM fosforanu, 2,7 mM KCl, 140 mM NaCl, pH 7,3.

Bufor rozcieńczający: dostarczony, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0

Bufor elucyjny: 10 mM zredukowanego glutationu, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Aby przygotować bufor elucyjny, wlej całą objętość 50 ml buforu rozcieńczającego dostarczonego z modułem do butelki zawierającej zredukowany glutation (0,154 g). Wstrząsać do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w podwielokrotnościach od 1 do 20 ml w temperaturze -20 °C.

Procedura

Ilość lizatu wymagana do wykrycia składników kompleksu białkowego jest różna. Użytecznym punktem wyjścia jest objętość lizatu odpowiadająca 106-107 komórkom hodowli tkankowej.

1. Zawiesić Glutathione Sepharose 4B w każdej kolumnie SpinTrap poprzez delikatne worteksowanie.
2. Odkręcić nakrętki kolumn o 1/4 obrotu. Usuń (i zachowaj) dolne zamknięcia.
3. Umieść każdą kolumnę w czystej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 lub 2 ml. Wirować przy 735 × g przez 1 min.
4. Odrzucić bufor z każdej probówki wirówkowej i założyć dolne zamknięcia.
5. Nałożyć do 600 µl lizatu zawierającego białko fuzyjne GST (przynętę) na kolumnę. Dla kontroli, nałóż taką samą objętość lizatu z GST (bez białka przynęty).
6. Zamknij bezpiecznie każdą kolumnę i wymieszaj przez delikatne, wielokrotne odwracanie. Inkubować w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
7. Zdjąć (i zachować) górne i dolne zamknięcia. Umieść każdą kolumnę w czystej, wstępnie oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 lub 2 ml.
8. Wiruj przy 735 × g przez 1 minutę, aby zebrać przepływ. Zachowaj przepływ do analizy    przez SDS-PAGE.
9. Umieść każdą kolumnę w czystej, wstępnie oznakowanej 1,5 lub 2 ml probówce do mikrowirówki.
10. Nałóż 600 µl 1× buforu płuczącego PBS na każdą kolumnę i powtórz procedurę wirowania. W razie potrzeby można wykonać dodatkowe płukanie 600 µL 1 × PBS. Ważne jest, aby zoptymalizować ten krok w celu uzyskania dobrych wyników.
11. Dodaj 100 do 200 µL buforu elucyjnego do każdej kolumny. Załóż górne i dolne zamknięcia. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 do 10 minut. Ważne jest, aby zoptymalizować ten krok w celu uzyskania dobrych wyników.
12. Zdejmij i wyrzuć górne i dolne zamknięcia i umieść każdą kolumnę w czystej 1,5 lub 2 ml probówce do mikrowirówki.
13. Wiruj wszystkie kolumny i zbierz eluaty. Analizować za pomocą SDS-PAGE.

Wybór warunków buforowych może wpływać na interakcje białko-białko.

Konieczne jest zoptymalizowanie warunków płukania dla każdego eksperymentu.

Słaby odzysk kompleksu może być spowodowany tym, że znacznik powinowactwa nie jest dostępny do wiązania z ligandem powinowactwa, gdy kompleks został utworzony. W takich przypadkach zaleca się zmianę miejsca znakowania (np,

W zależności od skali i wymaganej przepustowości, dostępnych jest wiele opcji dla testów ściągania GST (patrz "Materiały" na dole tej sekcji).

Tandemowa afirmacja oczyszczania, TAP

Metoda TAP, z modyfikacjami lub bez, została wykorzystana do oczyszczenia i identyfikacji kompleksów z drożdży, trypanosomów, roślin owocowych, ludzi i roślin.

TAP różni się od podejścia opisanego wcześniej poprzez zastosowanie dwóch kolejnych etapów chromatografii afitycznej w celu izolacji kompleksów białkowych. Uzasadnieniem zastosowania dwóch etapów czystości jest zwiększenie specyficzności procedury oczyszczania, a tym samym zmniejszenie liczby wyników fałszywie dodatnich. Ponadto warunki stosowane w tej metodzie są łagodne w celu zachowania integralności kompleksu i maksymalizacji wydajności. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w wielu przypadkach.

Podstawową zasadę TAP przedstawiono na Rysunku 2.5. W skrócie, białko przynęty (znany lub podejrzewany składnik kompleksu) jest znakowane zarówno białkiem A, jak i peptydem wiążącym kalmodulinę (CBP) z miejscem rozszczepienia proteazy wirusa tytoniu (TEV) między dwoma znacznikami. Podwójnie znakowane białko przynęty jest wyrażane na poziomie zbliżonym do naturalnego, ponieważ nadekspresja może wywoływać niefizjologiczne interakcje. Kompleks jest najpierw adsorbowany na kulkach sefarozowych IgG przez znacznik białka A i wymywany przez rozszczepienie za pomocą TEV. Kompleks jest następnie adsorbowany na kulkach sefarozowych z kalmoduliną (poprzez znacznik CBP) i eluowany za pomocą EGTA. Składniki kompleksu są rozdzielane przez SDS-PAGE i analizowane za pomocą spektrometrii mas.

Rysunek 2.5. Przegląd metody tandemowego oczyszczania czystości (TAP). Znacznik TAP zawiera CBP (peptyd wiążący kalmodulinę) połączony z domeną białka A oddzieloną miejscem rozszczepienia TEV. Zgoda na przedruk tego rysunku została udzielona przez Elsevier Global Rights Department.

W organizmach wyższych może być konieczne wyciszenie odpowiedniego endogennego genu dla białka docelowego poprzez zastosowanie technologii RNAi (iTAP).

Co-immunoprecypitacja

Immunoprecypitacja jest dobrze ugruntowaną techniką, która wykorzystuje przeciwciała do izolacji antygenów z surowych próbek biologicznych. Nazwa jest historyczna i wywodzi się z metod analizy opartych na reakcji wytrącania uzyskanej po zmieszaniu przeciwciała i antygenu w odpowiednim stosunku. Opisana tutaj metoda jest raczej testem pull-down niż reakcją wytrącania. Ko-immunoprecypitacja wykorzystuje przeciwciała skierowane na jeden (znany lub domniemany) składnik kompleksu. Przeciwciało wiąże się ze swoim antygenem, który jest częścią kompleksu wielobiałkowego. Zespół kompleksu przeciwciało-białko jest następnie wychwytywany poprzez dodanie do mieszaniny perełek sefarozowych z białkiem A lub białkiem G. Zasadę pokazano na Rysunku 2.6.

Alternatywnie, odpowiednie przeciwciało można unieruchomić na aktywowanej matrycy, takiej jak sefaroza aktywowana NHS. Podobnie, przeciwciało może być usieciowane z białkiem A lub białkiem G i wykorzystane do koimmunoprecypitacji składników kompleksów białkowych.

Rysunek 2.6. Zarys eksperymentu koimmunoprecypitacji.

Co-immunoprecypitacja z białkiem A lub białkiem G

Materiały Immunoprecipitation Starter Pack (zawiera nProtein A Sepharose 4 Fast Flow i Protein G Sepharose 4 Fast Flow)

Bufory do lizy

Tabela 2.3Typowe bufory lizujące dla komórek hodowli tkankowej ssaków

Nazwa	Opis	Sztywność
Surowość
Niska zawartość soli	1% Igepal™ CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	+
Nonidet™ P-40	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	++
RIPA	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% dezoksycholan sodu (DOC), 0,1% SDS, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	++
Wysoka sól	500 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.	++++

Inne bufory

PBS: 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4

Bufor płuczący: 50 mM Tris, pH 8

Bufor do próbek: 1% SDS, 100 mM DTT, 50 mM Tris, pH 7,5 (redukujący)
 

Przygotowanie pożywek

nProtein A Sepharose 4 Fast Flow i Protein G Sepharose 4 Fast Flow są dostarczane wstępnie spęcznione w 20% etanolu. Każde podłoże musi być dokładnie umyte przed użyciem w celu usunięcia 20% roztworu do przechowywania etanolu. Pozostałości etanolu mogą zakłócać kolejne procedury.

Potrzebne będzie 50 µL zawiesiny nProtein A Sepharose 4 Fast Flow lub Protein G Sepharose 4 Fast Flow 50% na próbkę.

1. Delikatnie wstrząśnij butelką nProtein A Sepharose 4 Fast Flow lub Protein G Sepharose 4 Fast Flow, aby ponownie zawiesić podłoże.
2. Użyj pipety z końcówką o szerokim otworze, aby usunąć wystarczającą ilość zawiesiny i przenieś zawiesinę do odpowiedniego pojemnika/rurki. W razie potrzeby odetnij końcówkę pipety, aby utworzyć większy otwór.
3. Osącz pożywkę przez wirowanie z prędkością 12 000 × g przez 20 s. Ostrożnie zdekantuj supernatant.
4. Przepłucz pożywkę, dodając 10 objętości buforu lizującego (patrz poniżej). Odwrócić w celu wymieszania.
5. Przepłukać pożywkę przez odwirowanie z prędkością 12 000 × g przez 20 s. Zdekantować supernatant.
6. Powtórzyć kroki 4 i 5 dla łącznie trzech płukań.

Do każdego ml oryginalnej zawiesiny pożywki dozowanej w kroku 2, dodać 0,5 ml buforu lizującego. Daje to zawiesinę o stężeniu 50%. Przechowywać w temperaturze 4ºC i dobrze wymieszać przed użyciem.

Wiązanie antygenu

1. Pobrać próbki (500 µL) do nowych probówek mikrowirówkowych.
2. Dodać surowicę poliklonalną (0.5 do 5 µL), supernatantu hodowli tkankowej hybrydoma (5 do 100 µL), płynu puchlinowego (0,1 do 1 µL) lub oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych (dodać objętość odpowiadającą 1 do 5 µg). W przypadku kontroli należy użyć przeciwciał nieimmunologicznych, które są jak najbardziej zbliżone do specyficznego przeciwciała (na przykład surowicę poliklonalną należy porównać z normalną surowicą tego samego gatunku).
3. Delikatnie mieszać przez 1 godzinę w temperaturze 4ºC.

Precypitacja kompleksów immunologicznych

1. Dodaj 50 µl zawiesiny n-białka A na sefarozie 4 Fast Flow lub białka G na sefarozie 4 Fast Flow (50% zawiesiny).
2. Delikatnie mieszać przez 1 godzinę w temperaturze 4°C.
3. Wirować przy 12 000 × g przez 20 s i zachować osad (kulki).
4. Przepłukać osad trzykrotnie 1 ml buforu do lizy i raz buforem do przemywania. Wirować przy 12 000 × g przez 20 s pomiędzy każdym płukaniem i ostrożnie usunąć supernatanty.

Dysocjacja i analiza

1. Zawiesić końcowy osad w 30 µL buforu do próbek.
2. Podgrzać do 95°C i inkubować przez 3 minuty.
3. Wirować przy 12 000 × g przez 20 s w celu usunięcia kulek. Ostrożnie przenieś supernatant do czystej probówki.
4. Dodaj 1 µL 0,1% błękitu bromofenolowego do supernatantu.
5. Analizuj supernatant za pomocą SDS-PAGE, a następnie barwienia białek, trawienia trypsyną i analizy za pomocą spektrometrii mas.

.

Materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch