Metody wzrostu drożdży

Drożdże są uważane za modelowe systemy do badań eukariotycznych, ponieważ wykazują szybki wzrost i mają rozproszone komórki. Co więcej, replikacja i izolacja mutantów komórek drożdży jest wykonywana ze względną łatwością, ponieważ mają one dobrze zdefiniowany system genetyczny. Co najważniejsze, drożdże mają bardzo wszechstronny system transformacji DNA, który można skutecznie wykorzystać do produkcji białek.

Drożdże są powszechnie hodowane w pożywce YPD. "Y" w YPD odnosi się do ekstraktu drożdżowego, zawierającego rozpuszczalne w wodzie związki powstające, gdy drożdże są zmuszone do samostrawiania. "P" odnosi się do peptonu, mieszaniny peptydów i aminokwasów przygotowanych przez trawienie białka zwierzęcego proteazami. "D" odnosi się do dekstrozy lub glukozy, źródła węgla dla drożdży. YPD zawiera niezbędne składniki odżywcze, aby zaspokoić wymagania metaboliczne komórek. Jednak niektóre pożywki wymagają określonego składu, aby zaspokoić potrzeby aplikacji, opracowano różnorodne pożywki syntetyczne. Poszczególne składniki pożywek syntetycznych mogą być modyfikowane w zależności od potrzeb eksperymentu.

• Protokoły wzrostu drożdży w różnych pożywkach
• Zachowanie i ożywienie szczepu drożdży
• Kultury drożdży
  • Podłoża do hodowli drożdży
  • Syntetyczne suplementy do pożywek drop-out
  • Inne suplementy dla kultur drożdży

PROTOKOŁY WZROSTU DROŻDŻY W RÓŻNYCH MEDIACH

Poniższe protokoły mogą być stosowane do hodowli i utrzymania drożdży w podłożach płynnych i stałych:

Wzrost drożdży w podłożu YPD Broth

1. Zawiesić 50 g podłoża YPD Broth (Product No. Y1375h) w 1 litrze wody destylowanej
2. Autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C
3. Zaszczepić kultury drożdży (pochodzące z bulionów/płytek drożdżowych) w wolnych od detergentów probówkach/klatkach zawierających przygotowaną płynną pożywkę. Pożywka nie powinna być większa niż jedna trzecia objętości probówki lub jedna piąta całkowitej objętości kolby
4. Wiruj zawartość krótko, aby rozproszyć komórki
5. Hodować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem przy 300 obr/min (dla kolb) lub 350 obr/min (dla probówek)

Wzrost drożdży na podłożu YPD Agar

1. Zawiesić 65 g podłoża YPD Agar (Nr produktu. Y1500) w 1 l wody destylowanej
2. Podgrzać do wrzenia mieszając do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników
3. Autoklawować przez 15 minut w temperaturze 121 °C
4. Wylać około 25-30 ml pożywki agarowej na sterylne płytki i pozostawić w komorze z przepływem laminarnym
5. Nakłuć (drożdże uzyskane z płytki YPD)/rozsiać (drożdże pochodzące z hodowli bulionowych) komórki na płytkach agarowych i inkubować w temperaturze 30 °C

Uwaga: Pojedyncze kolonie drożdży można zaobserwować po około 24 godzinach, ale inkubacja trwająca ponad 48 godzin jest konieczna, zanim będzie można je wykorzystać do celów replikacji. Tempo wzrostu kultur drożdży przy użyciu syntetycznych suplementów pożywki drop-out jest o ~50% wolniejsze.

PRZECHOWYWANIE I OŻYWIANIE HODOWLI DROŻDŻY

Komórki drożdży wyhodowane przy użyciu powyższych metod mogą być przechowywane zamrożone w glicerolu w temperaturze -70 °C przez ponad 3 lata lub w bogatych skosach pożywki w temperaturze 4 °C przez 6 miesięcy do roku. Płytki YPD z komórkami drożdży mogą być również przechowywane w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące szczelnie zamknięte folią Parafilm®. Protokoły konserwacji i ożywienia komórek drożdży są wymienione poniżej:

Konserwacja komórek drożdży

1. Przygotuj sterylny 30% (w/v) roztwór glicerolu (Nr produktu. G5516)
2. Dodaj 1.0 mL roztworu glicerolu do 4 mL sterylnych zakręcanych fiolek
3. Weź 1.0 ml bulionu drożdżowego we wczesnej fazie stacjonarnej/późnej fazie logarytmicznej zeskrobać duże inokulum ze świeżo wyhodowanej płytki
4. Zawiesić ponownie w 1 ml sterylnego 30% roztworu glicerolu
5. Wymieszać, zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -70 °C

Uwaga: Komórki drożdży mogą być również przechowywane w podobny sposób przy użyciu 8% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO, nr produktu. D8418).

Ożywienie szczepu drożdży

1. Zeskrob zamrożony wywar sterylną wykałaczką lub igłą bakteriologiczną
2. Nakładaj komórki drożdży na odpowiednią płytkę i inkubuj w temperaturze 30 °C

Uwaga: Unikać rozmrażania bulionu.

KULTURY DROŻDŻY

Drożdże są zwykle hodowane w podłożu YPD lub podłożu syntetycznym w temperaturze 30 ° C. Oferujemy szeroką gamę pożywek i suplementów do konkretnych zastosowań, zarówno w postaci proszku, jak i płynu.

Referencje

1. Sherman F. 2002. Getting started with yeast.3-41. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50954-x

2. MacDonald PN. 2001. Two-Hybrid Systems. https://doi.org/10.1385/1592592104

3. Treco DA, Winston F. 2008. Growth and Manipulation of Yeast. Current Protocols in Molecular Biology. 82(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1302s82

4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494