Protokoły wzrostu drobnoustrojów

Hodowla E. coli

LB Broth (Miller) to granulowana pożywka do hodowli E. coli w skali od małych hodowli do fermentacji. Granulki zapewniają szybkie i równomierne rozpuszczanie w wodzie oraz zapobiegają zbrylaniu się pożywki i wdychaniu unoszącego się w powietrzu proszku. 

Wymagane materiały:

Odczynniki	Sprzęt
Czyste E. coli hodowla	inkubator szafkowy (37 °C)
LB - Miller	Inkubator z wytrząsarką (37 °C)
Płytki LB - Miller	Naczynia hodowlane, sterylne
	Kolby hodowlane, sterylne

Inicjacja kultury starterowej

1. Pobierz pojedynczą kolonię ze świeżo posianej płytki i zaszczep kulturę starterową 3 do 5 ml podłoża.
   
2. Użyć odpowiedniego antybiotyku i inkubować w temperaturze 37 °C* przez około 8 godzin, wytrząsając przy 250-300 rpm.
   
3. Użyć kultury starterowej do zaszczepienia kultury nocnej. Rozcieńczyć kulturę starterową w stosunku od 1:500 do 1:1000 w dużej kolbie z odpowiednią objętością pożywki i inkubować w temperaturze 37°C* przez 12 do 16 godzin, wytrząsając przy 250-300 obr/min.

*Ta temperatura dotyczy standardowych bakterii E. coli. Niektóre bakterie wymagają innych temperatur hodowli.

Hodowla zawiesinowa E. coli

1. Przygotować pożywkę LB poprzez odważenie odpowiedniej pożywki w proszku i dodanie do wody w sterylnej kolbie
2. Poddać bulion autoklawowaniu i schłodzić do temperatury pokojowej
   .br> (Alternatywnie można użyć gotowej do użycia pożywki LB)
   
3. W komorze z przepływem laminarnym przenieś około 1 ml całonocnego E. coli do kolby
4. Zamknij ujście kolby sterylnymi bawełnianymi (niechłonnymi) korkami; upewnij się, że kolba nie jest szczelnie zamknięta
5. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C z ciągłym wytrząsaniem

.

Nakładanie E. coli

1. Przygotuj agar LB, odważając odpowiednią pożywkę w proszku, agar i wodę do sterylnej kolby
2. Autoklawuj pożywkę i ostudź na tyle, aby można było manipulować kolbą
3. W komorze z przepływem laminarnym wlej około 25-30 ml agaru LB do sterylnych płytek
   
4. Pozostaw do zastygnięcia w komorze z przepływem laminarnym./li>
5. Pozwolić płytkom zastygnąć w komorze przepływu laminarnego z lekko otwartymi pokrywkami
   (Płytki można również przechowywać w pozycji odwróconej w temperaturze 4°C do wykorzystania w przyszłości)
   (Alternatywnie można użyć gotowych do użycia płytek z agarem LB)
   • Lekko zarysować powierzchnię zamrożonego E. coli za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej
   • Pobierz kolonię E. coli z płytki z hodowlą za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej
   • Dodaj 10-100 µL hodowli zawiesinowej E. coli i dodać na płytkę z agarem LB
     • Przeciągnąć pętlę przez płytkę z agarem LB
     • Rozsmarować hodowlę na całej płytce za pomocą sterylnego szklanego rozsiewacza
   • /li>
6. Odwróć i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37°C

.

Zaawansowane protokoły

Plating Bacteriophage M13

Wymagane materiały:

Odczynniki	Sprzęt
Czyste E. coli hodowla	inkubator szafkowy (37 °C)
LB agar EZMix™ (Nr produktu. L7533)	Łaźnia wodna (47 °C)
Odpowiedni antybiotyk selekcyjny	Płytki do hodowli
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) (Product No. I6758)	15 mL polipropylenowe probówki hodowlane (sterylne)
X-gal (Nr produktu. B9146)
chlorek magnezu

1. Przygotować czystą kulturę E. coli zaszczepiając pojedynczą kolonię w 5 ml podłoża LB lub YT.
2. Przygotować dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia bakteriofaga M13 w podłożu LB lub YT.
3. Przygotować agar LB lub podłoże YT uzupełnione 5mM MgCl₂ w sterylnych probówkach; wyrównać w temperaturze 47°C; dodać odpowiednie ilości roztworów X-gal i IPTG.
4. Dodać seryjnie rozcieńczone buliony bakteriofaga M13 do 100 µL czystej kultury bakteryjnej; wymieszać przez delikatne worteksowanie.
5. Wlej agar LB lub podłoże YT z X-gal i IPTG do probówek zawierających zainfekowane bakterie; wymieszaj przez delikatne worteksowanie.
6. Przenieś zawartość na płytkę i zawiruj, aby równomiernie rozprowadzić zainfekowane bakterie.
7. Pozwolić płytkom zastygnąć; odwrócić i inkubować płytki w temperaturze 37 ° C.
8. Bladoniebieskie płytki bakteriofaga M13 pojawiają się na trawniku wzrostu bakterii.

.

Następujące składniki bulionu bakteryjnego są oferowane przez naszą firmę:

Składniki bulionu bakteryjnego<	Nazwa	Format
Y0875	Wybierz ekstrakt drożdżowy	Proszek
N4767	N-Z-Amine® EKC
Y1626	Select Yeast Extract, EZMix™ powder	EZMix™
T2559	EZMix™ Tryptone

Referencje

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Parija S. 2009. Textbook of Microbiology and Immunology. Elsevier India.

3. Types of Growth Media Used to Culture Bacteria. [Internet].[updated 01 Aug 2016; cited 04 Aug 2020]. Available from: http://www.scienceprofonline.org/microbiology/types-culture-media-for-growing-bacteria