Wskazówki dotyczące obsługi próbek | Testy MILLIPLEX^®

Właściwa obsługa i przygotowanie próbek są niezbędne do przeprowadzania testów immunologicznych. Od pobierania i przechowywania próbek, po wymagania dotyczące ich rozcieńczania, każdy krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania najlepszych wyników badań. Większość zestawów MILLIPLEX^® została przetestowana pod kątem surowicy, osocza i supernatantu hodowli komórkowej, a niniejszy krótki przewodnik przedstawia najlepsze praktyki w zakresie przygotowywania tych typów próbek do użycia w testach multipleksowych MILLIPLEX^®.

Czytaj więcej

• Ogólne wskazówki dotyczące przygotowania i obsługi próbek
• /PL/plPrzygotowanie surowicy
• /PL/plPrzygotowanie osocza
• /PL/plPrzygotowanie supernatantu z hodowli komórkowej
• /PL/plPrzygotowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC)
  • Krótki protokół dla PBMC
• Urine Preparation
• MILLIPLEX^® Zestawy wymagające specjalnego przygotowania próbek
• Protokoły wykorzystujące inne typy próbek
• Informacje o żądaniu

Ogólne wskazówki dotyczące przygotowania próbek i obchodzenia się z nimi

• Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania próbek.
• Stężenia analitów mogą różnić się między surowicą a osoczem. Jeśli masz możliwość użycia surowicy lub osocza, zalecamy wybranie surowicy, ponieważ jest ona czystsza.
• Wszystkie próbki muszą być przechowywane w probówkach polipropylenowych. Nie należy przechowywać próbek w szkle.
• Worteksowanie jest zalecane do jednorodnego przygotowania próbek.
• Prawidłowa i spójna technika pipetowania jest kluczem do uzyskania dokładnych danych, zwłaszcza jeśli wielu użytkowników będzie generować dane we współpracy.
  • Utrzymywanie prawidłowo skalibrowanych pipet jest ważne, a szkolenie w zakresie najlepszych praktyk pipetowania może znacznie zwiększyć precyzję pipetowania.
  • Używaj pipetowania odwrotnego w celu dokładniejszego dozowania.  Zapoznaj się z filmem na górze strony, aby nauczyć się tej techniki.
• Postępuj zgodnie z instrukcjami protokołu MILLIPLEX^® dotyczącymi obsługi próbek i rozcieńczeń.
  • Zawsze czytaj cały protokół przed kontynuowaniem. Procedury są zoptymalizowane pod kątem uzyskania najlepszych wyników i mogą się różnić w zależności od zestawu.
  • Niektóre zestawy MILLIPLEX^® do oznaczania biomarkerów metabolicznych wymagają dodania do próbek inhibitorów proteazy i/lub fosfatazy.
  • Inne zestawy MILLIPLEX^® mogą wymagać ekstrakcji lub zakwaszenia próbki.

Przygotowanie surowicy

• Rurki do separacji surowicy (SST) są zalecane w celu uzyskania wyższej jakości separacji.
• Pozwolić krwi krzepnąć przez co najmniej 30 minut przed wirowaniem przez 10 minut z prędkością 1000 x g w celu oddzielenia komórek.
• Usuń surowicę i natychmiast przeprowadź test lub podziel próbki i przechowuj je w temperaturze od -20° do -80°C.
• Hemoliza może skutkować zwiększoną aktywnością proteolityczną i degradacją analitu, głównie z powodu enzymów uwalnianych z lizowanych komórek.
  • Śladowa hemoliza w próbkach pobranych z inhibitorami proteazy może być akceptowalna, ale hemoliza brutto prawdopodobnie zakłóci wydajność testu.
  • Jeśli musisz użyć surowicy z hemolizą lub lipemią, unikaj zanieczyszczeń, lipidów i komórek.
• Hemoglobina (w stężeniu 10 mg/ml) jest znana z tego, że zakłóca interakcje antygen/przeciwciało.
• Próbki należy rozcieńczyć zgodnie z określonym protokołem zestawu MILLIPLEX^®.

Przygotowanie osocza

• Zaleca się pobieranie osocza przy użyciu EDTA jako antykoagulantu.
• Należy zachować ostrożność podczas stosowania heparyny jako antykoagulantu, ponieważ nadmiar heparyny zapewni fałszywie wysokie wartości.
  • Używaj nie więcej niż 10 IU heparyny na ml pobranej krwi.
• Inne antykoagulanty nie zostały dokładnie przetestowane i nie są zalecane.
• Wirować przez 10 minut z prędkością 1000 x g w ciągu 30 minut od pobrania krwi.
• Natychmiast pobrać osocze i przeprowadzić analizę lub podzielić próbki i przechowywać je w temperaturze od -20° do -80°C.
• Rozcieńczyć próbki zgodnie z określonym protokołem zestawu MILLIPLEX^®.

Przygotowanie supernatantu z hodowli komórkowej

• Wiruj próbki w celu usunięcia zanieczyszczeń i natychmiast przeprowadź analizę lub podziel próbki i przechowuj je w temperaturze od -20°C do -80°C.
• W przypadku supernatantów z hodowli komórkowych należy użyć świeżej pożywki hodowlanej jako roztworu matrycy w ślepej próbie, krzywych standardowych i kontrolach.
• Jeśli pożywka z hodowli komórkowej jest używana jako roztwór matrycy, należy upewnić się, że nie ma w niej aktywnych proteaz, fosfataz lub suplementów, które mogą zakłócać test lub generować niedokładne wyniki (np, cytokiny, ludzka surowica itp.).
• Jeśli próbki są rozcieńczane w buforze testowym, użyj buforu testowego jako matrycy.
• Niektóre zestawy mogą mieć określone wymagania, zawsze należy zapoznać się z protokołem zestawu przed zaplanowaniem eksperymentu.

Przygotowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

Uwaga: Przygotowanie próbki PBMC jest najważniejszym krokiem do uzyskania powtarzalnych wyników.

• Silne detergenty są używane w buforze lizującym. Wystarczająca ilość detergentu w buforze do lizy jest wymagana do solubilizacji białek. Nie należy przekraczać całkowitego stężenia białka 5-6 mg/ml.
  • Zaobserwowano spadek sygnału dla kilku analitów przy użyciu próbek PBMC przy całkowitym stężeniu białka 6 mg/ml (nie dodano wystarczającej ilości buforu lizującego do solubilizacji białek).
• Ponieważ w buforze lizującym stosowane są silne detergenty, próbki lizatu wymagają wystarczającego rozcieńczenia w buforze testowym w celu rozcieńczenia silnych detergentów. Należy unikać stężenia białka całkowitego w lizacie poniżej 2 mg/ml.
  • Jeśli stężenie białka w lizacie jest niższe niż 2 mg/ml, wówczas zbyt duża ilość buforu lizującego z silnymi detergentami będzie obecna w teście i spowoduje zmniejszenie sygnału.
  • Jeśli stężenie białka poniżej 2 mg/ml jest nieuniknione, zalecamy użycie mniejszej ilości próbki, minimalizując w ten sposób objętość buforu lizującego obecnego w teście.
• Optymalne całkowite stężenie białka wynosi 2-6 mg/ml. Używając PBMC ustaliliśmy, że 10 μL buforu lizującego na 1 milion komórek PBMC daje około 2 mg/mL. Dodanie 10 μL próbki o stężeniu 2 mg/mL i 15 μL buforu testowego dało dobre wyniki. Jako punkt wyjścia zaleca się dodanie 10 μL buforu lizującego na 2 miliony komórek PBMC.
  • Nigdy nie rozcieńczaj próbek w buforze lizującym, raczej rozcieńczaj w buforze testowym, który nie zawiera silnych detergentów.

Krótki protokół dla PBMC

1. Jeśli PBMC pochodzą z zamrożonego materiału, zaleca się pozostawienie komórek na 24 godziny w pełnej pożywce. (Odzyskiwanie trwające krócej niż 24 godziny prowadzi do spadku sygnału). Po 24 godzinach odzyskiwania należy policzyć komórki przy użyciu odpowiedniego licznika komórek.
2. Wiruj PBMC z prędkością 1000 x g przy użyciu wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usuń supernatant i przemyj komórki za pomocą PBS.
4. Wiruj PBMC z prędkością 1000 x g za pomocą wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń bufor płuczący i dodaj 10 μL buforu lizującego (z 2x stężonymi inhibitorami proteazy dodanymi tuż przed użyciem) na 2 miliony komórek.
6. Delikatnie worteksuj przez 30 sekund przed przeniesieniem lizatu komórek do probówki wirówkowej.
7. Delikatnie kołysz lizat komórek przez 10 minut w temperaturze 4°C. Peelingować nieuszkodzone komórki i organelle z prędkością 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
8. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki wirówkowej.
9. Zaleca się, przynajmniej po raz pierwszy, określenie całkowitego stężenia białka. Jeśli nie, zaleca się przeprowadzenie miareczkowania lizatu, zaczynając od 10 μL próbki + 15 μL buforu testowego 1 i wykonując seryjne rozcieńczenie 1:1 w buforze testowym 1. Dodaj inhibitory proteazy (takie jak Protease Inhibitor Cocktail I lub AEBSF) i/lub inhibitory fosfatazy do buforów lizujących "domowej roboty".

Aby uzyskać więcej informacji na temat całkowitego stężenia białka i buforów do lizy MILLIPLEX^®, pobierz naszą Tips & Tricks brochure.

Urine Preparation

Typowo, pomiar analitów w moczu wymaga 24-godzinnej zbiórki moczu lub drugiej porannej zbiórki moczu. W przypadku drugiego porannego moczu wartość analitu jest normalizowana względem kreatyniny, tj, analit jest wyrażony jako jednostki/mg kreatyniny.

• Krótko odwiruj próbki, aby usunąć zanieczyszczenia.
• W przypadku korzystania z zamrożonych próbek zaleca się całkowite rozmrożenie próbek, dobre wymieszanie przez worteksowanie i odwirowanie przed użyciem w teście w celu usunięcia cząstek stałych.
• Należy określić optymalny współczynnik rozcieńczenia próbek. Bufor testowy dostarczony w zestawie powinien być użyty jako rozcieńczalnik próbki.

Zestawy MILLIPLEX^® wymagające specjalnego przygotowania próbki

Tabela 1 opisuje specjalne przygotowanie próbki wymagane dla niektórych zestawów multipleksowych MILLIPLEX^®.

Uwagi

1. DPP-IV (produkt nr DPP4-010) jest stosowany w stężeniu 10 µL na ml krwi.
2. Pefabloc lub AEBSF (produkt nr 101500) jest stosowany w stężeniu 1 mg/ml krwi.
3. Koktajl inhibitora proteazy I (produkt nr 20-201).
4. Koktajl inhibitora proteazy (Produkt nr P2714).
5. Aktywne i całkowite nie mogą być używane razem w tym samym teście.

Tabela 1. Zestawy MILLIPLEX^® wymagające specjalnego przygotowania próbki, w tym określonego typu próbki i obróbki/inhibitora.

Protokoły wykorzystujące inne typy próbek

Dostępne są protokoły dla typów próbek wykraczających poza te, które zostały przetestowane w zestawach MILLIPLEX^®. Niektóre przykłady opisano w Tabeli 2.

Pełna lista informacji o typach próbek paneli MILLIPLEX^® znajduje się w Załączniku 3 w naszej Broszura Tips & Tricks.

Request Information

Chcesz dowiedzieć się więcej o testach multipleksowych MILLIPLEX^®? Sprawdź nasze FAQs lub wypełnij poniższy formularz.

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.