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qPCRリファレンス遺伝子選択プロトコル

PCR技術プロトコルの目次

qPCR条件の最適化

qPCR条件の最適化は、確実性の高いあるアッセイを開発する上で重要です。最適化が十分でないと、反復間の再現性がなく、非効率的で感度の低いアッセイとなります。2つの主要なアプローチとして、プライマー濃度またはアニーリング温度、あるいはその両方の最適化が挙げられます。

遺伝子発現データの解析には、安定的なリファレンスまたはローディングコントロールが必要です。通常は、1つ以上のリファレンス遺伝子をリファレンスとして使用します適切なリファレンス遺伝子は、サンプルの相違や実験上の処理に影響されません。また、リファレンス遺伝子は、実験モデルごとに選定しなければなりません。試験的に用いて安定的なリファレンス遺伝子を選択する場合は、その遺伝子をさまざまな生物学的経路から選択し、発現が独立的に制御されることが重要です。理想的にはすべてのリファレンス遺伝子候補を、5つのテスト試料と5つのコントロール試料からなるグループに対してテストします。 

器具

  • 定量PCR用装置
  • PCRセットアップのためのクリーンベンチ（オプション）

試薬

  • 1:100に希釈されたcDNA（通常、高発現のリファレンス遺伝子を検出するには、これよりも薄いcDNAで十分です。発現量が中程度の遺伝子の場合は、1:10の希釈率を使用してください）。
  • KiCqStart™ SYBR®グリーンReadyMix™（KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03。各装置への適合は表P4-6を参照してください）。
  • PCRグレード純水：PCRグレード純水（W1754またはW4502）を20 mLのアリコートに小分けして凍結します。各反応には新しいアリコートを使用します。
  • 試験用リファレンス遺伝子のためのフォワードおよびリバースプライマー（10 µMの保存溶液）。注記：適切な遺伝子は表P15-37に示すとおりです。これらの遺伝子は、表に示す設計済みアッセイのKiCqStart™プライマーとして入手できます（プライマーの配列は製品の納品時に提供されます）。 
Hot Start ReadyMixes（Taq、バッファー、dNTP、リファレンス色素、MgCl2）
KiCqStart™ SYBR® Green qPCR ReadyMix™、
カタログ番号：KCQS00		KiCqStart™ SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox、
カタログ番号： KCQS01		KiCqStart™ SYBR® Green qPCR ReadyMix™ with ROX、
カタログ番号： KCQS02		KiCqStart™ SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ、
カタログ番号： KCQS03
適合装置：適合装置：適合装置：適合装置：
Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P™Applied Biosystems 7700 
Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900 
Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast 
Bio-Rad/MJ Opticon™ Applied Biosystems 7900HT 
Cepheid® SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™ 
Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™ 
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s   
Illumina Eco qPCR   
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000   
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000   
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q   
Roche LightCycler® 480   
表P17-42.SYBR®グリーンPCRミックス選択ガイド

消耗品

注記

リファレンス遺伝子マウスヒトラット
CANXM_Canx_1H_CANX_1R_Canx_1
HPRT1NAH_HPRT1_1R_Hprt1_1
PGK1M_Pgk1_1H_PGK1_1R_Pgk1_1
TBPM_Tbp_1H_TBP_1R_Tbp_1
YWHAZM_Ywhaz_1H_YWHAZ_1R_Ywhaz_1
ATP5BM_Atp5b_1H_ATP5B_1R_Atp5b_1
SDHAM_Sdha_1H_SDHA_1R_Sdha_1
TUBB2BNAH_TUBB2B_1R_Tubb2b_1
UBCM_Ubc_1H_UBC_1R_Ubc_1
PPIANAH_PPIA_1R_Ppia_1
GUSBM_Gusb_1H_GUSB_1R_Gusb_1
GAPDHNAH_GAPDH_1NA
TUBA1ANAH_TUBA1A_1R_Tuba1a_1
ACTBM_Actb_1H_ACTB_1R_Actb_1
表P15-37.リファレンス遺伝子になりうる遺伝子候補とKiCqStart™製品番号（KSPQ12012）

方法

1.    各リファレンス遺伝子に必要な反応の回数を計算します。1サンプルあたり2回の反応に十分な量の
ミックスを調製します。たとえば、テスト試料とコントロール試料がそれぞれ5つあり、テンプレートなしのコントロール（NTC）が2つある場合は、22回分の反応液を調製します。ピペッティング
エラーを想定し、10%多めに計算します。

2. 表P15-38に従い、各リファレンス遺伝子プライマーペアのqPCRマスターミックスを調製します。cDNAを
マスターミックスに添加してはなりません。十分に混合し、気泡の発生を防ぎます。

試薬単一の反応液20 µL
あたりの容量（µL）
2× KiCqStart™ SYBR®グリーンqPCR ReadyMix™10
フォワードプライマー（10 µM）0.9
リバースプライマー（10 µM）0.9
PCRグレード水3.2
表P15-38.リファレンス遺伝子選択のためのqPCRマスターミックス

3.    マスターミックス15 µLを所定のチューブ／ウェルに添加します。

4.    適切なテンプレート5 µL（試料またはNTC用の水）を所定のチューブ／ウェルに添加します。

5.    チューブにキャップを被せるか、またはプレートをシールで封じ、ラベル付けします（ラベルが機器の励起／検出光路を覆い隠さないように注意してください）。

6.    下記の3ステッププロトコル（表P15-39）に従い、反応をランします。ステップ1～3を40サイクル繰り返します。

7.    データを解析して、最も安定的なリファレンス遺伝子または遺伝子の組み合わせを選定します。

サイクル反応条件温度（℃）時間（秒）
初期変性／ホットスタート9530
ステップ1～3を40サイクル繰り返す
ステップ1955
ステップ25810
ステップ37215
表P15-39.リファレンス遺伝子選択のためのPCRサイクル反応条件

注記：標準解離曲線のプロトコル（データ収集）を使用してください。

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