ホームポリメラーゼ連鎖反応のアプリケーション標準的な逆転写プロトコル（2ステップ）

標準的な逆転写プロトコル（2ステップ）

逆転写

逆転写（RT）は、逆転写酵素とdNTPを使用してRNAをcDNAに変換するプロセスです。

RTステップをTotal RNAに対して実施することにより、サンプル中の代表的なすべてのRNA転写産物から包括的なcDNAを生成するか（通常、2ステッププロトコルによる）、RTステップを遺伝子特異的なアプローチで実施することにより、目的のRNAのみをcDNAに変換することが可能です（通常、1ステッププロトコルに従う）。

以下の実験プロトコルは、実験条件に合わせて修正することが可能な、基本的なRTプロトコルとして利用できます。一般的には、cDNAを希釈してからPCR/qPCRに添加する2ステッププロセスを用いてcDNAを調製するか、両プロセスが順次実行される1ステップ反応液を調製します。

装置

標準的なPCR装置または加熱ブロック
RTセットアップのための層流フード（オプション）

試薬

RNA（約1 µg/µLの保存溶液）。
ReadyScript^™ 2ステップcDNA合成キット（シグマRDRT）。別の逆転写キットを、オリゴdTプライマーまたはランダムプライマー、あるいはその両方と組み合わせて使用することもできます。
PCRグレード純水：PCRグレード純水（W1754またはW4502）を20 mLに小分けして凍結します。各反応には新しい小分けチューブを使用します。

消耗品

滅菌済みフィルターピペットチップ
滅菌済み1.5 mLねじ蓋式微量遠心チューブ（CLS430909）
PCRチューブおよびプレートは、目的とする形式に合ったものを選択してください。
• 個別の薄肉200 µL PCRチューブ（シグマZ374873またはP3114）
• プレート
- 96ウェルプレート（シグマZ374903）
- 384ウェルプレート（シグマZ374911）
• プレートシールまたはキャップ
- ThermalSeal RTS™シーリングフィルム（シグマZ734438）
- ThermalSeal RT2RR™フィルム（シグマZ722553）

方法

調製

ReadyScript^™キットの構成要素およびRNAサンプルを氷上に置きます。
混合し、軽く遠心して内容物をチューブの底に集めます。

反応

コントロールを含む必要な反応数を決定します。すべての反応に必要な各構成成分の容量を計算して合わせます（ピペッティングエラーを想定して10%増やします）。表P10-26に従い、0.2 mLチューブまたは氷上に置かれた96ウェルプレートを使用してください。PCRプレートを使用する場合は、プレート概略図に従い、試薬が正しいウェルに添加されるようにします。

各反応液を密閉した後、軽くボルテックスして内容物を混合します。軽く遠心して構成成分を反応チューブの底に集めます。
表P10-27に従い、反応ミックスをインキュベートします。

cDNA合成の終了後、5～10倍に希釈した第一鎖反応液（2～4 µL）をPCR増幅に使用します。
注記：ReadyScript^™試薬を使用する場合は、希釈していないcDNA 2～4 µLを、阻害を引き起こすことなくPCRに添加することができます。必要に応じて、cDNA産物を10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mM EDTAで希釈し、－20℃で保存することができます。