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Kit ApopTag Plus Peroxidase per il rilevamento dell′apoptosi In Situ

The ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit detects apoptotic cells by labeling & detecting DNA strand breaks by the indirect TUNEL method.

• Sinonimo/i: In Situ Apoptosis Detection Kit
• Codice UNSPSC: 12161503
• eCl@ss: 32161000
• NACRES: NA.84

Proprietà

• Livello qualitativo: 100
• Produttore/marchio commerciale: ApopTag; Chemicon^®
• Metodo di rivelazione: colorimetric
• Condizioni di spedizione: dry ice

Descrizione

Descrizione generale

Il kit ApopTag Plus con perossidasi, per rilevamento in situ dell′apoptosi, rileva le cellule apoptotiche in situ marcando e rilevando le rotture dei filamenti di DNA con il metodo indiretto TUNEL. Il kit fornisce reagenti sufficienti per colorare 40 campioni con immunoperossidasi e include vetrini di controllo ApopTag(R), tampone DAB e substrato. I risultati sono visualizzati mediante microscopio in campo chiaro.

I kit ApopTag con perossidasi sono qualificati per l'uso nella colorazione istochimica e citochimica dei seguenti campioni: tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, sezioni criostatiche, sospensioni cellulari, citospin e colture cellulari. Sono stati sviluppati metodi whole mount (34, 45). (Vedi scheda tecnica Sez. V. per riferimenti bibliografici).

La specificità della colorazione dei kit ApopTag con perossidasi è stata dimostrata da Chemicon e da molti altri laboratori. Chemicon ha testato molti tipi di modelli cellulari e sistemi tissutali, tra cui: (a) prostata, timo e intestino crasso umani (dati interni); (b) lobo ventrale di prostata di ratto post-castrazione (21), (c) linfociti di timo di ratto trattati in vitro con desametasone (3, 13), (d) arti di embrione di topo di 14 giorni (1) ed (e) ghiandola mammaria di ratto in regressione dopo lo svezzamento (36). Sui modelli di timociti e prostata è stata utilizzata l'elettroforesi su gel di agarosio per valutare l′entità della frammentazione del DNA visualizzata come DNA laddering. Si è osservato che il livello massimo di frammentazione corrispondeva al picco di colorazione delle cellule. Diverse pubblicazioni provenienti da laboratori in tutto il mondo hanno dimostrato la validità dei kit ApopTag. (Vedi scheda tecnica Sez. V. Riferimenti bibliografici, pubblicazioni che citano i kit ApopTag)

Applicazioni

INTRODUCTION

ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kits label apoptotic cells in research samples by modifying DNA fragments utilizing terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) for detection of apoptotic cells by specific staining.

This manual contains information and protocols for the ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit.

Principles of the Procedure

The reagents provided in ApopTag Peroxidase Kits are designed to label the free 3′OH DNA termini in situ with chemically labeled and unlabeled nucleotides. The nucleotides contained in the Reaction Buffer are enzymatically added to the DNA by terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) (13, 31). TdT catalyzes a template-independent addition of nucleotide triphosphates to the 3′-OH ends of double-stranded or single-stranded DNA. The incorporated nucleotides form an oligomer composed of digoxigenin-conjugated nucleotide and unlabeled nucleotide in a random sequence. The ratio of labeled to unlabeled nucleotide in ApopTag Peroxidase Kits is optimized to promote anti-digoxigenin antibody binding. The exact length of the oligomer added has not been measured.

DNA fragments which have been labeled with the digoxigenin-nucleotide are then allowed to bind an anti-digoxigenin antibody that is conjugated to a peroxidase reporter molecule (Figure 1A). The bound peroxidase antibody conjugate enzymatically generates a permanent, intense, localized stain from chromogenic substrates, providing sensitive detection in immunohistochemistry or immunocytochemistry (i.e. on tissue or cells). This mixed molecular biological-histochemical systems allows for sensitive and specific staining of very high concentrations of 3′-OH ends that are localized in apoptotic bodies.



The ApopTag system differs significantly from previously described in situ labeling techniques for apoptosis (13, 16, 38, 46), in which avidin binding to cellular biotin can be a source of error. The digoxigenin/anti-digoxigenin system has been found to be equally sensitive to avidin/biotin systems (22). The sole natural source of digoxigenin is the digitalis plant. Immunochemically-similar ligands for binding of the anti-digoxigenin antibody are generally insignificant in animal tissues, ensuring low background staining. Affinity purified sheep polyclonal antibody is the specific anti-digoxigenin reagent used in ApopTag Kits. This antibody exhibits <1% cross-reactivity with the major vertebrate steroids. In addition, the Fc portion of this antibody has been removed by proteolytic digestion to eliminate any non-specific adsorption to cellular Fc receptors.

Results using ApopTag Kits have been widely published (see Sec. V. References, Publications Citing ApopTag Kits). The ApopTag product line provides various options in experimental design. A researcher can choose to detect staining by brightfield or fluorescence microscopy or by flow cytometry, depending on available expertise and equipment. There are also opportunities to study other proteins of interest in the context of apoptosis when using ApopTag Kits. By using antibodies conjugated with an enzyme other than peroxidase and an appropriate choice of substrate, it is possible to simultaneously examine another protein and apoptosis using ApopTag Peroxidase Kits.

Componenti

Tampone di equilibrazione 90416 3,0 mL da -15°C a -25°C

Tampone di reazione 91417 2,0 mL da -15°C a -25°C

EnzimaTdT 90418 0,672 mL da -15°C a -25°C

Tampone di arresto/lavaggio 90419 20 mL da -15°C a -25°C

Anti-Digossigenina-Perossidasi* 90420 3,0 mL da 2°C a 8°C

Vetrini coprioggetto in plastica 90421 100 per conf. Temp.ambiente

Vetrini di controllo 90422 2 per conf temp. ambiente.

Substrato DAB 90423 130 μL da 2°C a 8C°C

Tampone di diluizione 90424 6,5 mL da 2°C a 8°C

*anticorpo policlonale di pecora purificato per affinità

Numero di campioni per kit: i materiali forniti sono sufficienti per colorare 40 campioni di tessuto di circa 5 cm2 ciascuno, se usati secondo le istruzioni. Se si usano i kit per campioni montati su vetrini, il tampone di reazione si esaurisce prima degli altri reagenti.

Stoccaggio e stabilità

Conservare il kit tra -15°C e -25°C fino al primo utilizzo. Dopo il primo utilizzo, il kit ha durata di tre mesi se si conserva l′enzima TdT (90418) tra -15°C e -25°C e gli altri componenti tra 2°C e 8°C.

Precauzioni

1. I seguenti componenti del kit contengono cacodilato di potassio (acido dimetilarsinico) come tampone: tampone di equilibrazione (90416), tampone di reazione (90417) ed Enzima TdT (90418). Questi componenti sono nocivi se ingeriti; evitare il contatto con la cute e gli occhi (indossare guanti e occhiali) e lavare immediatamente le aree di contatto.

2. Il substrato DAB (3,3′ diaminobenzidina) (90423) è stato dimostrato essere un potenziale cancerogeno e va quindi evitato il contatto con la pelle. In caso di contatto con la pelle, sciacquare abbondntement con dH2O.

3. L′anticorpo coniugato (90420) contiene lo 0,08% di azoturo di sodio come conservante.

4. L′Enzima TdT (90418) contiene glicerolo e non congela a -20°C. Per ottimizzare la durata di conservazione non scaldare il reagente a temperatura ambiente prima di prelevarlo.

Note legali

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Esclusione di responsabilità

Salvo diversa indicazione nel nostro catalogo o in altra documentazione fornita dall′azienda insieme al prodotto, i nostri prodotti sono destinati esclusivamente a scopi di ricerca e non devono essere utilizzati per altre finalità, inclusi a titolo esemplificativo ma non esaustivo, fini commerciali non autorizzati, applicazioni diagnostiche in vitro, usi terapeutici ex vivo o in vivo o qualsiasi altro tipo di assunzione o applicazione rivolta agli esseri umani o agli animali.

Informazioni sulla sicurezza

• Pittogrammi: GHS08,GHS07,GHS09
• Avvertenze: Danger
• Indicazioni di pericolo: H317,H341,H350,H373,H411
• Consigli di prudenza: P202 - P260 - P273 - P280 - P302 + P352 - P308 + P313
• Classi di pericolo: Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - Muta. 2 - Skin Sens. 1 - STOT RE 2 Inhalation
• Organi bersaglio: Respiratory Tract
• Codice della classe di stoccaggio: 6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects