Histopaque^® Sűrűséggradiens médiumok hibaelhárítási útmutatója

Mark Frei

A Histopaque és az ACCUSPIN™ sejtszeparációs technikákban való használatának hibaelhárítására vonatkozó alábbi ajánlásokat a műszaki támogatásunk tudósai állították össze az ügyfélproblémák megoldása során tett megfigyelések és tapasztalatok alapján. Ez az útmutató a Histopaque használata során megfigyelt leggyakoribb hibaforrásokkal foglalkozik, de nem tekinthető átfogó listának.

A Histopaque/ACCUSPIN használata során megfigyelt tipikus problémák
Vér- vagy sejtminták hibaelhárítási tippek

Vér- vagy sejtminták hibaelhárítási tippek
Histopaque/ACCUSPIN hibaelhárítási tippek
Technikai hibaelhárítási tippek
Műszerek

A Histopaque/ACCUSPIN használata során megfigyelt tipikus problémák

• Nehézséget okoz a mononukleáris vagy polimorfonukleáris sejtek elkülönítése az emberi vérből
• Nehézségek a mononukleáris vagy polimorfonukleáris sejtek elkülönítésében patkány vagy egér vérből
• Alacsony visszanyerés
• Vörösvérsejt, trombocita vagy neutrofil szennyeződés az elkülönített sejtekben

Vér- vagy sejtminták Hibaelhárítási tippek

Az ok	A megoldás
Vérvétel >24 órával a szétválasztás előtt	A szétválasztás előtt 2-6 órával levett vért használja. A >24 órán belül levett vért nehezebb lesz elválasztani, és a százalékos visszanyerés és az életképesség alacsonyabb lesz.
A vér az alvadásgátló hiánya miatt megalvadt	A vákuumcsövek használata javasolt előre kimért mennyiségű alvadásgátlóval. Fecskendő használata (véralvadásgátló nélkül) nem ajánlott.
A vér alvadása a nem teljes keverés miatt	Győződjön meg arról, hogy a vérvétel után a véralvadásgátlót tartalmazó vákuumcsöveket jól összekeverte.
A használt antikoaguláns nem alkalmas Histopaque elválasztó alkalmazáshoz	A következő antikoagulánsok alkalmasak Histopaque alkalmazáshoz:       - 15-30 egység heparin per mL teljes vér        - 1.25-1,75 mg EDTA per mL teljes vér ACA-A (Acid Citrate Dextrose formula A) használható véralvadásgátlóként. Az elválasztás után a keletkező mononukleáris sejtsáv szélesebb lesz, mint más véralvadásgátlók esetében. Ez normális, és a sejtek felhasználhatók.
	A vérminta túl meleg, és a vérvétel után túl hamar megkísérelték az elválasztást	A vörösvértest-szennyeződés oka lehet, hogy a vér nem szobahőmérsékletű. A vérvételt követően a vért legalább 30-45 percig szobahőmérsékleten kell hagyni hűlni. Ha közvetlenül a vérvétel után használják fel, a gyűjtött mononukleáris sejtek száma alacsony lesz. Az elválasztási eljárások akkor optimálisak, ha mind a vér, mind a Histopaque 18-20 °C-os, elfogadható hőmérséklet-tartományban 18-26 °C között.
Vérminta nagy sókoncentrációjú PBS-szel hígítva	A Histopaque-kal használt történelmi sejtelválasztási technika magában foglalja a vér PBS-szel történő hígítását (1:1). Ezt követően megállapítottuk, hogy nem minden PBS-készítmény alkalmas a Histopaque-kal való használatra. A 150 mM foszfátpuffert és 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldatok olyan PBS-oldatok, amelyek sókoncentrációja túl magas a Histopaque-kal való használathoz. A 10 mM foszfáthoz közelebbi PBS molaritások alkalmasabbak a Histopaque-kal való használatra. A sejtek életképessége magasabb marad, ha a magas sókoncentrációjú PBS-t megfelelő sejttenyésztő közeggel helyettesítjük.
Különbségek a donor vérének fiziológiájában (amikor az egyes minták rosszabb visszanyerést mutatnak)	A magas lipidszint, a reumafaktor, a vérszegénység és a gyógyszeres kezelés mind lehetséges okai egy adott donor vérének rossz elválasztásának. Ha a plazma nem tiszta, az magas lipidszintre utal.
A kisállatminta más folyadékokkal vagy szilárd anyagokkal való szennyeződése	A nem tűvérzésből nyert vér, pl., farokmintavétellel, gyakran elfogadhatatlan a felhasználásra a szőrszálak és más testnedvek jelenléte miatt a levett vérben. Ez gyakran az alvadási kaszkád beindulását eredményezi, ami vérrögképződést eredményez. Javasoljuk, hogy az állatot áldozzák fel, és a vért vagy az aortán vagy a vena caván vagy más nagy véredényen keresztül nyerjék. Alternatív megoldásként gyermekvákuumcső is használható a vérvételhez.
A fehérvérsejtek elzáródása magas fehérvérsejt-tartalmú mintákban	A vörösvérsejtek és a poliszukróz érintkezésekor aggregátumok képződhetnek, ami a fehérvérsejtek elzáródását eredményezi. Ha ezekbe az aggregátumokba szorulnak, a fehérvérsejtek a centrifugacső aljára kerülnek. A rutin vérminták esetében a százalékos visszanyerés gyakran magasabb a hígítatlan vér esetében. A csontvelőt, a köldökzsinórvért és a kórosan magas fehérvérsejtszámú donoroktól származó mintákat azonban hígítani kell a vörösvérsejt-aggregátumok méretének csökkentése és a fehérvérsejtek visszanyerésének javítása érdekében.
A vér nem megfelelő hígítása vagy szennyezett PBS-szel vagy táptalajjal történő hígítása	.Ha a vért a Histopaque®-ra történő betöltés előtt hígítják, fennáll annak az esélye, hogy vagy a puffer vagy a médium formulációja nem kompatibilis a Histopaque-kal, vagy a PBS vagy a sejttenyésztő médium szennyezett. Ha a vért hígították, és a hozam gyenge, ismételje meg a kísérletet a minta hígítása nélkül.
FBS-t vagy más hordozófehérjét tartalmazó sejttenyésztő táptalajjal történő hígítás	A Histopaque-kal történő felhasználásra szánt minták hígításakor a PBS helyettesíthető FBS nélküli sejttenyésztő táptalajjal. Ha a vért FBS-t tartalmazó sejttenyésztő táptalajjal hígítják, a kinyert sejtek száma alacsonyabb lesz. A sejtek elkülönítése és legalább egyszeri mosás után a Histopaque eltávolítása érdekében FBS adható a tenyésztő táptalajhoz a későbbi mosás vagy tárolás céljából. Az első mosás után a fehérje, például FBS hozzáadása a mosóközeghez tovább védi a sejteket a károsodástól.
A sejtek elkülönítése a buffy coat-ból Histopaque használatával	A buffy coat-ot megfelelő véralvadásgátlóban történő vérgyűjtéssel és centrifugálással állítják elő. A vörösvérsejtek a cső aljára pelletálódnak. Közvetlenül a vörösvérsejtes réteg tetején egy szürke réteg lesz. Ez a szürke réteg a buffy coat, és a vérben lévő összes fehérvérsejtet képviseli. A szürke réteg fölött lesz a plazma. A friss vérből készített buffy coat alkalmas a Histopaque segítségével történő elválasztásra. Ha a sejtek több naposak, pl, ha a buffy coats adományozott vérből származik, a sejtek nem biztos, hogy elfogadható hozamot biztosítanak. A Buffy coats-ot legalább 1:2 vagy 1:4 arányban kell hígítani, mielőtt a Histopaque gradiensre töltjük.
A sejtek izolálása buffy coatból ACCUSPIN™ csövek használatával	A buffy coat preparátumok nem használhatók ACCUSPIN csövekben. Az ACCUSPIN-csövek megfelelő működéséhez bizonyos mennyiségű vörösvértestre van szükség, és a buffy coats nem tartalmaz elegendő vörösvértestet az ACCUSPIN-csövekben való használathoz.

Histopaque/ACCUSPIN Hibaelhárítási tippek

Az ok	A megoldás	Megoldás
A Histopaque bakteriális szennyeződése	A Histopaque steril oldatként készül. Nem tartalmaz tartósítószereket a szennyeződés esélyének csökkentése érdekében. Ha szennyeződés gyanúja merül fel, használjon friss üveg Histopaque-ot.
A Histopaque hőmérséklete túl hideg	Ha a Histopaque-ot vagy a töltött ACCUSPIN csöveket hidegen használják, a hozam jellemzően nagyon alacsony, és a sejtek csomósodása figyelhető meg. A vörösvérsejtek szennyeződése is lehet a Histopaque nem szobahőmérsékletének következménye. A hőmérséklet rendkívül fontos az eljárás elvégzésekor. A 2-8 °C-on tárolt 100 ml vagy 500 ml Histopaque palacknak több órába telhet, amíg 18-20 °C-os hőmérsékletet ér el. Ha a Histopaque használatát tervezi, javasoljuk, hogy előző nap vegye ki a Histopaque-ot a hűtőszekrényből, és hagyja a palackokat egy éjszakán át a padon állni. Ez biztosítja, hogy az oldat szobahőmérsékletű és használatra kész legyen. Egy másik lehetőség, hogy a megfelelő mennyiségű Histopaque-ot minden egyes centrifuga- vagy ACCUSPIN-csőbe átöntjük, és hagyjuk, hogy a kisebb térfogatok akklimatizálódjanak a szobahőmérséklethez. A sejtsáv összegyűjtése és az első mosás elvégzése után elfogadható, ha a további mosási lépéseket 4 °C-on végezzük el.

Technikai hibaelhárítási tippek

Az ok	A megoldás
A vér mononukleáris sejtek számára szánt gradiensekre történő rétegzésénél nem szükséges a pontos rétegzés. Ha egy kis keveredés történik a vér és a Histopaque között, a sejtsáv így is megfelelően kialakul. A vér rétegezése után fontos, hogy a centrifugacsöveket azonnal a centrifugába helyezze. Ha túl sok idő telik el, a Histopaque teljes rétege vörösre színeződik a vörösvértestektől. A "cseppképződés" mértékétől függően ez csökkentheti a mononukleáris sejtek százalékos visszanyerését. Az egyszerre feldolgozott csövek számát korlátozni kell a sejtek szétszóródásának csökkentése érdekében.
A Histopaque® 1077 és a Histopaque 1119 megfelelő rétegezése a neutrofilek izolálásakor./td>	A Histopaque 1077 és a Histopaque 1119 együttes használata esetén a neutrofilek izolálásához gondos technikát kell alkalmazni az oldat határfelületén történő keveredés megakadályozására. Ellenőrizze a határfelület épségét Schlieren optika segítségével. A rétegek közötti határfelületen bármilyen kavarodásnak vagy keveredésnek nyilvánvalónak kell lennie, ha a csövet a fény felé tartjuk. Ha a határfelületet megfelelően készítették elő, akkor egy élesen elhatárolt vonalnak kell lennie. Ha az élesen elhatárolt vonal nincs jelen, vagy ha a határfelületen kavargás van, dobja el a csövet, és kezdje elölről. Fontos az is, hogy a gradienst azonnal felhasználja, amint kialakult. Az 1077 és az 1119 között nincs kémiai különbség; a két oldat ugyanazokat az összetevőket tartalmazza, és idővel elkezdenek együtt diffundálni. Ha ez megtörténik, a visszanyerés gyenge lesz, vagy nem is lesz.
Szennyeződés a porkesztyűben használt porból	Porkesztyű nem használható. A kesztyűpor a sejtek aggregálódását okozza. Csak púdermentes kesztyűt használjon.
Nem megfelelő centrifugálási erő használata	A centrifugát ellenőrizni kell a megfelelő kalibrálás biztosítása érdekében. A túlzott erő (nagyobb centrifugálási sebesség) csökkenti a hozamot.
A felhasználás előtti sterilizáláshoz autoklávozással sterilizálták a hisztopakot	A hisztopakot nem lehet autoklávozással sterilizálni; az autoklávozás karamellizálja az oldatban lévő poliszukrózist, ami barnává változtatja azt. A Histopaque steril szűrése 0,22 mikronos szűrőn keresztül elfogadható.
Lemezke- vagy neutrofil szennyeződés a sejtekben az elválasztás után	A lemezke- vagy neutrofil szennyeződés általában annak a következménye, hogy a sejtsáv gyűjtésekor túl sok plazmát vagy Histopaque 1077 vagy 1083-t gyűjtöttek. Csökkentse a begyűjtött plazma vagy Histopaque mennyiségét.
Túl nagy mennyiséget használt a sejtpellet mosásához	A sejtpellet mosása általában eltávolítja a trombocitákat. Ha nagy mennyiségű mosóoldat marad a sejtpellet fölött, az több vérlemezkét eredményez a sejtszuszpenzióban. Távolítson el annyi mosóközeget, amennyit csak lehet a sejtpellet megzavarása nélkül. A vérlemezkék általában nem pelletálódnak 1000 × g 1000 × g 10 percig tartó centrifugálási erő alatt. A mosási lépésekhez ajánlott alacsonyabb centrifugálási sebességeknél a vérlemezkéknek a mosóközegben vagy a felülúszóban szuszpendálva kell maradniuk.
A sejtpellet nem képez egyetlen sejtszuszpenziót	A sejtpellet újraszuszpendálásakor csak kis mennyiségű mosóoldatot szabad használni. Az eljárás 15 ml-es vagy 50 ml-es centrifugacsőben történő végrehajtása esetén legfeljebb 0,5 ml mosóoldatot ajánlunk. Ezt a mosóközeget óvatosan öblítsük át a pelletre. Előfordulhat, hogy a sejtszuszpenziót többször kell a pipettába húzni és adagolni. Amint a sejtek egyetlen sejtszuszpenzióvá állnak össze, hozzáadható a maradék mosóoldat, és az oldat centrifugálható.
A sejtek mosás közbeni elvesztése a centrifugacső falához való tapadás miatt	A sejtek időnként a centrifugacső falához tapadnak. Ha a sejtek valóban megtapadnak a polisztirol csőben, a cső zavarosnak tűnik. Váltson másik tétel polisztirol centrifugacsőre, vagy váltson más típusú műanyagra, például polietilénre. Leggyakrabban a polisztirol csöveknél figyelhető meg ez a probléma, de más típusú műanyagról is jelentettek már sejttapadást.