Lipopoliszacharidok Termékinformációk

Szinonim: LPS

Munka lipopoliszacharidokkal (LPS)

A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sejtfalának jellegzetes összetevői; a Gram-pozitív baktériumokban nem találhatók meg. A membrán külső rétegében lokalizálódnak, és a nem kapszulázott törzseknél a sejtfelszínen vannak kitéve. Hozzájárulnak a külső membrán integritásához, és védik a sejtet az epesók és a lipofil antibiotikumok hatása ellen.¹

A lippopoliszacharidok egy hidrofób lipidből (A lipid, amely a molekula toxikus tulajdonságaiért felelős), egy hidrofil magpoliszacharidláncból és egy hidrofil O-antigén poliszacharid oldalláncból állnak. A legtöbb esetben az O-specifikus láncok olyan oligoszacharidok ismétlődő egységeiből épülnek fel, amelyek törzs-specifikus szerkezeti változatosságot mutatnak. A cukorösszetevők, azok szekvenciája és kapcsolódási módjuk határozza meg az egyes törzsek szerológiai O-specifikusságát. Ezek a fő meghatározói a Salmonella fajok szerotípusainak osztályozásának. Az O-láncok változatossága a Enterobacteriaceae ben az evolúció során talán azért alakult ki, hogy az enterális baktériumok a sejtfelszínükön új (a baktérium szerotípusára jellemző) specifitások kialakításával elkerülhessék a gazdaszervezet immunrendszerét.¹

Amióta a lipopoliszacharidok antigén tulajdonságokat kölcsönöznek a sejtnek, O-antigéneknek nevezik őket. A lipopoliszacharidok fő antigénként részt vesznek a különböző gazda-parazita kölcsönhatásokban. Úgy tűnik, hogy megvédik a Gram-negatív baktériumokat a fagocitózistól és a lízistől.¹ A közös szerotípusú baktériumok felszíni antigénjei (O csoport, H csoport vagy LPS) azonos ellenanyagválaszt váltanak ki. A szerotípusokra példa az O55:B5 és az O26:B6 az E. coli baktérium esetében. A megnevezések immunológiai osztályozások, amelyek meghatározzák, hogy melyik antitest melyik törzset ismerte fel. A különböző törzseknek lehetnek közös antigén meghatározóik.

Ha egy vad baktériumtörzset UV-fénnyel besugároznak vagy mutagén vegyületeknek teszik ki, mutálódni fog. Az a néhány mutáció, amely nem halálos, életképes mutánsokat (nyers törzseket) eredményez, amelyek általában nem fordulnak elő a természetben, és amelyek néhány egyedi tulajdonsággal rendelkeznek. A mutánsokban a lipopoliszacharidképzést kódoló gének is megváltozhatnak, és rövidebb poliszacharidláncú LPS képződhet. Ra, Rb, Rc, Rd, Re, stb. (ahol a, b, c, stb... az 1., 2., 3., stb... fokot jelöli) egy adott LPS poliszacharid hosszát jelöli. Ra és Re a leghosszabb, illetve legrövidebb lánchosszúságú mutánsokat jelöli.² A legszélsőségesebb mutánsok a Re mutánsok, amelyek olyan LPS-t termelnek, amely a mag egyedüli alkotórészeként Lipid A és 3-deoxi-D-manno-oktuloszonsavból (2-Keto-3-deoxioktonát, KDO) áll.²  A durva törzsekből származó Lipid A és lipopoliszacharidok KDO-tartalmát vizsgálják.³

A tisztított endotoxint általában lipopoliszacharidnak vagy LPS-nek nevezik, hogy megkülönböztessék a természetesebb, komplexebb, sejtmembránhoz kapcsolódó formától. A poliszacharidlánc mag része közös a vad és mutáns baktériumtörzsek LPS-ében.

Az LPS-ből a poliszacharidlánc hidrolízissel történő eltávolításával lipid A keletkezik, akár a természetben előforduló, citotoxikus difoszforil formában⁴ akár a kevésbé toxikus, monofoszforil formában.^5,6 Minél hosszabb a poliszacharidlánc, annál hosszabb és nehezebb a hidrolízis. A hosszú poliszacharidlánccal rendelkező LPS-nek viszonylag alacsony a lipid-A-tartalma, amelyet a hidrolízis nagy mennyiségű melléktermékétől (oligoszacharidok és szacharid-monomerek) kell megtisztítani. Így a lipid A hozama alacsony és a visszanyerés gyenge. A rövid poliszacharidlánccal rendelkező LPS-t (mutáns baktériumokból származó LPS-t) ezért lipid A termékek előállítására használják. A lipid A zsírsav-részeinek eltávolítása egy méregtelenített LPS⁷ -t eredményez, amelynek endotoxinszintje körülbelül 10 000-szer alacsonyabb, mint a kiindulási LPS-é.

Az LPS molekuláris szerkezetét tanulmányozták.^8,9 Mivel az LPS heterogén és hajlamos különböző méretű aggregátumokat képezni, a molekulatömeg nem túlságosan sokatmondó. A jelentések szerint azonban az 1-4 millió vagy annál nagyobb tartományban van. Ha az LPS-t SDS-szel és hővel kezelik, a molekulatömeg 50-100 kDa tartományba esik. A bakteriális endotoxinok legtisztább formájukban, erős felületaktív anyagok jelenlétében és kétértékű kationok hiányában 10-20 kDa makromolekulákból állnak. Felületaktív anyagok hiányában és kétértékű kationokat szekvenáló szerek, például EDTA jelenlétében az LPS feltehetően micelláris szerkezetbe rendeződik, amelynek molekulatömege körülbelül 1000 kDa. Ez a bakteriális LPS legkisebb formája, amely valószínűleg létezik vizes folyadékokban. Kétértékű kationok, például Ca²⁺ és Mg²⁺ jelenlétében olyan kétrétegű struktúra látszik létezni, amely átmegy egy 0,2 μm-es membránon, de nem megy át egy 0,025 μm-es membránon. Kétértékű kationok jelenlétében vízben akár 0,1 μm átmérőjű LPS-vezikulák is kialakulhatnak. Az LPS önaggregációja általában a molekula lipid A komponensének függvénye, amely a hidrofób felületekhez való kötődés képességét is biztosítja.

Az LPS előállítható TCA,¹⁰ fenol,¹¹ vagy fenol-kloroform-petróleuméter (durva törzsek esetében)¹² extrakcióval. A TCA-val extrahált lipopoliszacharidok szerkezetileg hasonlóak a fenolos extrakcióhoz. Elektroforetikus mintázatuk és endotoxicitásuk hasonló. A fő különbségek a nukleinsav- és fehérje-szennyeződések mennyiségében vannak. A TCA-kivonat körülbelül 2% RNS-t és körülbelül 10% denaturált fehérjéket tartalmaz. A fenolos kivonat akár 60% RNS-t és kevesebb mint 1% fehérjét tartalmaz. A gélszűréses kromatográfiás tisztítással eltávolítjuk a fenolos extrakcióban lévő fehérjék nagy részét, de olyan terméket hagyunk hátra, amely még mindig 10-20% nukleinsavat tartalmaz. A további tisztítás ioncserélő kromatográfiával olyan LPS-terméket eredményez, amely <1% fehérjét és <1% RNS-t tartalmaz. Különböző fehérje- és/vagy RNS-tartalmú LPS-t kínálunk.

Lipopoliszacharidjaink legalább 500 000 EU (endotoxin egység)/mg endotoxinszintet tartalmaznak, hacsak másként nem jelezzük. Egy nanogramm endotoxin megfelel 0,5 EU-nak 1 ng anyagban, ha 500 000 EU/mg (Limulus lizátum vizsgálat) és 10 EU (kromogén vizsgálat).

A LPS-készítményeket széles körben használják az LPS szerkezetének,¹³ metabolizmusának,¹⁴ immunológia,¹⁵ fiziológia,¹⁶ toxicitás,¹⁷ és bioszintézis.¹⁸  Azokat a növekedésserkentő faktorok, például az interleukinok szintézisének és szekréciójának indukálására is használták.¹⁹

FITC (fluoreszcein-izotiocianát), TRITC (tetrametirodamin-izotiocianát) és TNP (trinitrofenil) konjugátumokat állítottak elő az LPS és FITC, TRITC, illetve 2,4,6-trinitrobenzolszulfonsav reakciójával.²⁰ Ezeket a bakteriális LPS-re adott T-független B-sejtes immunválasz kutatásában használják.²⁰

Védelmek és jogi nyilatkozat

Kizárólag laboratóriumi felhasználásra. Nem gyógyszeres, háztartási vagy egyéb felhasználásra.

Tárolás/stabilitás

A pufferben vagy táptalajban 1 mg/ml-es oldatok kb. egy hónapig stabilak 2-8 °C-on. Fagyasztott aliquotok akár 2 évig is tárolhatók. Ismételt fagyasztási/felolvasztási ciklusok nem javasoltak. Az oldatokat szilanizált tartályokban kell tárolni, mivel az LPS kötődhet a műanyaghoz és bizonyos üvegtípusokhoz (különösen <0,1 mg/ml koncentrációban). Ha az LPS koncentrációja >1 mg/ml, az injekciós üveg oldalára történő adszorpció elhanyagolható. Üvegedények használata esetén az oldatokat legalább 30 percig kell vortexelni az adszorbeált termék újrafeloldásához.

Elkészítési útmutató

A termék vízben (5 mg/ml) vagy sejttenyésztő közegben (1 mg/ml) oldódik, és zavaros, halványsárga oldatot ad. Koncentráltabb, bár még mindig zavaros oldatot (20 mg/ml) vizes sóoldatban vittünk véghez, miután felvertük és felmelegítettük
70-80 °C-ra.²¹ A lipopoliszacharidok olyan molekulák, amelyek minden oldószerben micellákat képeznek. Vízben és foszfátpufferelt sóoldatban zavaros oldatok figyelhetők meg. A szerves oldószerek nem adnak tisztább oldatokat. A metanol zavaros szuszpenziót eredményez úszókkal, míg a víz homogénen zavaros oldatot ad.

A sejtkultúrában való felhasználáshoz az LPS-t úgy kell rekonstruálni, hogy 1 ml steril kiegyensúlyozott sóoldatot vagy sejttenyésztő közeget adunk egy
fiolához (1 mg), és óvatosan kevergetjük, amíg a por feloldódik. Az oldatokat további steril kiegyensúlyozott sóoldatokkal vagy sejttenyésztő közeggel tovább lehet hígítani a kívánt munkakoncentrációig.

LPS táblázat

forrás Szervezet		Kivonási módszer	Gélszűrés	Gélszűrés γ-irr.	Ioncsere		Ioncsere	Detoxikált	Gélszűrés FITC jelölés	Gélszűrés TNP jelölés
O26:B6 E. coli	Phenol - L8274 TCA -L3755	L2762./a>	L2654<
O55:B5 E. coli	Fenol - L2880 TCA - L4005	L2637	L6529		L4524	L9023	F8666
O111:B4 E. coli	L2637	L3012	L4391	L3024	L3023	F3665	T3382
O127:B8 E. coli	Fenol - L3129 TCA - L3880	L3137	L4516	L5024
O128:B12 E. coli	Fenol - L2755	L2887							T6769
E. coli EH-100 (Ra mutáns)	Ph/Chl/Pet - L9641
E. coli F-583 (Rd mutáns)	Ph/Chl/Pet - L6893
E. coli J5 (Rc mutáns)	Ph/Chl/Pet - L5014
E. coli K-235	Fenol - L2143	L2018
Klebsiella pneumoniae	Fenol - L4268
Pseudomonas aeroginosa 10	Phenol - <L9143 TCA - L7018	L8643
Salmonella abortus equi	Fenol - L5886 TCA - L6636	L1887
Salmonella enteritidis	Fenol - L6011	L2012	L7770	L4774
Salmonella minnesota		Fenol - <L6261 TCA - L7011	L2137	L4641
Salmonella minnesota törzs Re595 (Re mutáns)	Ph/Chl/Pet - L9764
Salmonella typhimurium		Fenol - L6511 TCA - L7261	L2262	L6143
Salmonella typhimurium SL1181 törzs (Re mutáns)	Ph/Chl/Pet - L9516
Salmonella typhimurium TV119 törzs (Ra mutáns) (Ra mutáns)	Ph/Chl/Pet - L6016
Salmonella typhosa	Fenol - L6386 TCA - L7136		L2387	<L7895
Serratia marcescens	Fenol - L6136

* = megszűnt termékszám
Ph/Chl/Pet = fenol:kloroform:petróleuméter

Hivatkozások

1. Mayer H, Tharanathan R, Weckesser J. 1985. 6 Analysis of Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria.157-207. https://doi.org/10.1016/s0580-9517(08)70475-6

2. Raetz CRH. 1990. Biochemistry of Endotoxins. Annu. Rev. Biochem.. 59(1):129-170. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.59.070190.001021

3. CYNKIN MA, ASHWELL G. 1960. Estimation of 3-Deoxy Sugars by Means of the Malonaldehyde?Thiobarbituric Acid Reaction. Nature. 186(4719):155-156. https://doi.org/10.1038/186155a0

4. Qureshi N, Takayama K, Heller D, Fenselau C. 1983. Position of ester groups in the lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 258(21):12947-51.

5. Chang C, Nowotny A. 1975. Relation of structure to function in bacterial O-antigens?VII. Endotoxicity of ?lipid A?. Immunochemistry. 12(1):19-28. https://doi.org/10.1016/0019-2791(75)90045-2

6. Qureshi N, Takayama K, Ribi E. 1982. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 257(19):11808-15.

7. Ding HF, Nakoneczna I, Hsu HS. 1990. Protective immunity induced in mice by detoxified salmonella lipopolysaccharide. Journal of Medical Microbiology. 31(2):95-102. https://doi.org/10.1099/00222615-31-2-95

8. JANN B, RESKE K, JANN K. 1975. Heterogeneity of Lipopolysaccharides. Analysis of Polysaccharide Chain Lengths by Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Eur J Biochem. 60(1):239-246. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1975.tb20996.x

9. Leive L, Morrison DC. 1972. [23] Isolation of lipopolysaccharides from bacteria.254-262. https://doi.org/10.1016/0076-6879(72)28025-9

10. Staub A. 1965. Bacterial Lipido-protinopolysaccharides (‘O’ Somatic Antigens) Extraction with Trichloroacetic Acid. Methods in Carbohydrate Chem. 592-93.

11. Westphal O, Jann K. 1965. Bacterial Lipopolysaccharides Extraction with Phenol-Water and Further Applications of the Procedure. Methods in Carbohydrate Chem. 583-91.

12. Galanos C, Luderitz O, Westphal O. 1969. A New Method for the Extraction of R Lipopolysaccharides. Eur J Biochem. 9(2):245-249. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00601.x

13. Strain S, Fesik S, Armitage I. 1983. Characterization of lipopolysaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance. J Biol Chem. 258(2):2906-10.

14. Munford RS, Andersen JM, Dietschy JM. 1981. Sites of tissue binding and uptake in vivo of bacterial lipopolysaccharide-high density lipoprotein complexes: studies in the rat and squirrel monkey.. J. Clin. Invest.. 68(6):1503-1513. https://doi.org/10.1172/jci110404

15. Morrison DC, Rudbach JA. 1981. Endotoxin-Cell-Membrane Interactions Leading to Transmembrane Signaling.187-218. https://doi.org/10.1007/978-1-4684-3917-5_6

16. Goodwin T. 1977. Biochemistry of Lipids II. Baltimore: Univeristy Park Press.

17. Kurtz H, Quast J. 1982. Effects of continuous intravenous infusion of Escherichia coli endotoxin into swine. Am J Vet Res. 43(2):262-8.

18. Rick PD, Young DA. 1982. Isolation and characterization of a temperature-sensitive lethal mutant of Salmonella typhimurium that is conditionally defective in 3-deoxy-D-manno-octulosonate-8-phosphate synthesis.. 150(2):447-455. https://doi.org/10.1128/jb.150.2.447-455.1982

19. Oppenheim JJ, Kovacs EJ, Matsushima K, Durum SK. 1986. There is more than one interleukin 1. Immunology Today. 7(2):45-56. https://doi.org/10.1016/0167-5699(86)90124-6

20. Skelly RR, Munkenbeck P, Morrison DC. 1979. Stimulation of T-independent antibody responses by hapten-lipopolysaccharides without repeating polymeric structure.. 23(2):287-293. https://doi.org/10.1128/iai.23.2.287-293.1979

21. Customer Report.

22. Fomsgaard A, Freudenberg MA, Bendtzen K, Galanos C. 1990. Quantitation and biological activities of native tumour necrosis factor from LPS-stimulated human monocytes. 98(1-6):529-534. https://doi.org/10.1111/j.1699-0463.1990.tb01067.x

23. Bleicher P, Rollins-Smith LA, Jacobs DM, Cohen N. 1983. Mitogenic responses of frog lymphocytes to crude and purified preparations of bacterial lipopolysaccharide (LPS). Developmental & Comparative Immunology. 7(3):483-496. https://doi.org/10.1016/0145-305x(83)90033-2

24. Sveen K, Skaug N. 1992. Comparative mitogenicity and polyclonal B cell activation capacity of eight oral or nonoral bacterial lipopolysaccharides in cultures of spleen cells from athymic (nu/nu-BALB/c) and thymic (BALB/c) mice. Oral Microbiol Immunol. 7(2):71-77. https://doi.org/10.1111/j.1399-302x.1992.tb00512.x

25. Hepper K, Garman RD, Lyons MF, Teresa GW. 1979. Plaque-forming cell response in BALB/c mice to two preparations of LPS extracted from Salmonella enteritidis. J Immunol. 122(4):1290-3.

26. Gardiner JS, Keil LB, DeBari VA. 1991. In vitro Formation of Complement Activation Products by Lipopolysaccharide Chemotypes of Salmonellaminnesota. Int Arch Allergy Immunol. 96(1):51-54. https://doi.org/10.1159/000235534

27. Salter M, Knowles RG, Moncada S. 1991. Widespread tissue distribution, species distribution and changes in activity of Ca2+-dependent and Ca2+-independent nitric oxide synthases. 291(1):145-149. https://doi.org/10.1016/0014-5793(91)81123-p

28. Mond JJ, Brunswick M. 2003. Proliferative Assays for B Cell Function. Current Protocols in Immunology. 57(1): https://doi.org/10.1002/0471142735.im0310s57

29. Geller DA, Lowenstein CJ, Shapiro RA, Nussler AK, Di Silvio M, Wang SC, Nakayama DK, Simmons RL, Snyder SH, Billiar TR. 1993. Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90(8):3491-3495. https://doi.org/10.1073/pnas.90.8.3491

30. Wrenger E, Baumann C, Behrend M, Zamore E, Schindler R, Brunkhorst R. 1998. Peritoneal mononuclear cell differentiation and cytokine production in intermittent and continuous automated peritoneal dialysis. American Journal of Kidney Diseases. 31(2):234-241. https://doi.org/10.1053/ajkd.1998.v31.pm9469493

31. Hawkins D, MacKay R, MacKay S, Moldawer L. 1998. Human interleukin 10 suppresses production of inflammatory mediators by LPS-stimulated equine peritoneal macrophages. Veterinary Immunology and Immunopathology. 66(1):1-10. https://doi.org/10.1016/s0165-2427(98)00181-0

32. Xu H, Gonzalo JA, St Pierre Y, Williams IR, Kupper TS, Cotran RS, Springer TA, Gutierrez-Ramos JC. 1994. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice.. 180(1):95-109. https://doi.org/10.1084/jem.180.1.95

33. Stuehr DJ, Marletta MA. 1985. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82(22):7738-7742. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7738

34. Wang J, Kester M, Dunn MJ. 1988. The effects of endotoxin on platelet-activating factor synthesis in cultured rat glomerular mesangial cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 969(3):217-224. https://doi.org/10.1016/0167-4889(88)90055-9

35. Cassatella MA, Bazzoni F, Flynn RM, Dusi S, Trinchieri G, Rossi F. 1990. Molecular basis of interferon-gamma and lipopolysaccharide enhancement of phagocyte respiratory burst capability. Studies on the gene expression of several NADPH oxidase components. J Biol Chem. 265(33):20241-6.