PAH-ok meghatározása paprikaporban SPE segítségével

Katherine K. Stenerson

Principal R&D Scientist

Cikk az Analytix Reporter 2. számából

Bevezetés

A paprika egy szárított édes paprikából készült fűszer, amelyet ízesítésre és színezésre használnak a konyha számos területén. A polinukleáris aromás szénhidrogénekkel (PAH) való szennyeződés akkor fordulhat elő, amikor a paprikanövények ki vannak téve ezeknek a szennyező anyagoknak a környezetben és/vagy a szárítási folyamat során. A fűszernövények használata a főzésben és az élelmiszer-előállításban egyre népszerűbbé válik, ezért a PAH-oknak, különösen a rákkeltő tulajdonságokkal rendelkező PAH-oknak való kitettség aggodalomra ad okot. Az Európai Unió (EU) odáig ment, hogy szabályozta a szárított fűszernövényekben és fűszerekben található számos PAH megengedett legmagasabb értékét.

Kifejezetten a paprika esetében a megengedett legmagasabb értéket 10 ng/g-ban határozták meg a benzo[a]pirénre és 50 ng/g-ban a benzo[a]pirén, krizén, benzo[a]antracén és benzo[b]fluorantén összegére.¹

A gyógynövényekben és fűszerekben található PAH-ok vizsgálatához használt mintaelőkészítési módszerek oldószeres extrakciót igényelnek, amelyet egy tisztítási lépés követ. Az eddig alkalmazott tisztítási módszerek közé tartozik a gélpermeációs kromatográfia (GPC) és a szilikagéllel végzett szilárd fázisú extrakció (SPE). ^2,3 Az elmúlt néhány évben a PAH-elemzésre szánt, nagy háttérrel rendelkező minták tisztítására egy új megközelítést alkalmaztak, amely egy Florisil^® felső réteget és egy Z-Sep/C18 alsó réteget tartalmazó kétrétegű SPE-kazettát tartalmaz. Ezt a Supelclean™ EZ-POP NP nevű patront a PAH-ok étolajokból történő közvetlen extrakciójára és biota minták kivonatainak tisztítására használták.^4,5 Ebben a munkában a PAH-okat paprikamintákból elemezték egy optimalizált QuEChERS extrakcióval, majd az EZ-POP NP SPE patron segítségével történő tisztítással. A laza szorbensekkel végzett QuEChERS tisztítással összehasonlítva az EZ-POP NP sokkal tisztább extrakciót eredményezett. Az extrakciós és az EZ-POP NP tisztítási eljárások optimalizálása >70%-os visszanyerést eredményezett 10 ng/g spiking szint mellett; belső standard korrekció nélkül számítva.

Kísérlet

A paprikamintákat egy helyi élelmiszerboltból szereztük be. A módszer pontosságának és reprodukálhatóságának értékeléséhez a mintákat 10 ng/g-os szinten a 1. táblázatban felsorolt PAH-okat tartalmazó keverékkel spicceltük. A spiccelés után a mintákat az extrakció előtt 1 órán át hagyták egyensúlyban állni. A mintaextraktumokat az 1. ábra-ban leírt eljárással készítettük el. Az extraktumokat ezután SPE-tisztításnak vetettük alá az EZ-POP NP patron segítségével, a 2. ábra szerint. Az elemzést GC/MS/MS módszerrel végeztük a 2. táblázatban bemutatott feltételek és az 1. táblázatban szereplő átmenetek alkalmazásával. Közvetlenül a GC-analízis előtt belső standard keveréket adtunk a kivonatokhoz, amelyet csak a műszer teljesítményének ellenőrzésére használtunk. A minták mennyiségi meghatározása egy mátrixhoz illeszkedő kalibrációs görbéhez viszonyítva történt, amelyet a paprikakivonattal nem szennyezett paprikakivonattal készítettünk.

1. táblázat Elemzett PAH-ok és a GC/ MS/MS elemzéshez használt átmenetek

	Peak No.	összetétel	RT	MRM 1	CE	MRM 2	CE	MRM 2
1	Naftalin-d8 (IS)	5.21	136/108	20	136/84		25
2	Naftalin	5.25	128/102	20	128/78		20
3	Acenaftilén	7.62	152/126	30	152/102		30
4	Acenaftén	7.88	153/127	30	152/126		30
5	Fluorén	9.2	166/165	15	165/164		20
6	Fenantrén	13.5	178/152	25	176/150		25
7	Antrakén	13.71	178/151	30	176/150		25
8	Fluorantén-d10 (IS)	20.76	212/208	35	210/208		15
9	Fluorantén	20.91	202/152	30	201/200	15
10	Pirén	22.95	201/200	15	200/174		25
11	Benz[a]antracén	29.42	228/226	30	114/101		10
12	Cyclopenta[cd]pirén	29.72	226/225	30	226/224		40
13	Kriczén	29.81	228/226	30	113/112	10<
14	5-metil-krízol (IS)	31.7	242/241	20	241/239	30
15	Benzo[b]fluorantén	33.60	252/250	30	126/113		10
16	Benzo[k]fluorantén	33.67	252/250	30	126/113		10
17	Benzo[j]fluorantén	33.71	252/250	30	126/113		10
18	Benzo[a]pirén	34.64	252/250	35	125/124		10
19	Perylene-d12	34.84	264/260	35	130/116	15
20	Dibenz[a,h]antracén	37.13	278/276	35	125/124	10
21	Indeno[1,2,3-cd] pirén	37.2	138/137	10	137/136	15
22	Benzo[g,h,i]perilén	38.13	138/137	15	137/136		15
23	Dibenzo[a,l]pirén	41.77	302/301	20	302/300		40
24	Dibenzo[a,e]pirén	43.27	302/301	40	302/300		40
25	Koronen (IS)	43.76	300/299	35	300/298		50
26	Dibenzo[a,i]pirén	44.29	302/301	40	302/300		40
27	Dibenzo[a,h]pirén	44.68	302/301	20	302/300	40

Eredmények és vita

GC/MS/MS körülmények. Az analízis körülményeit a PAH-okra optimalizáltuk. Magasabb injektálónyílás és MS hőmérsékletet, valamint  nyomás  impulzus  injektálást és 2 mm ID bemeneti bélést,  használtunk a    válasz és a csúcs alakjának javítása érdekében. A kemencehőmérsékleti program az Anderson és munkatársai által használt programon alapult, és szükséges volt az olyan izomerek, mint a benzo[b], [k] és [j] fluorantén kromatográfiás felbontásához, amelyeket nem lehet megkülönböztetni az MRM-átmenetek alapján.6 Ez a hőmérsékleti program a GC kapilláris oszlopával (SLB®-PAHms) kombinálva az összes izomercsoport megfelelő felbontását biztosította. Erre példa a 3. ábra a benzo[b], [k] és [j] fluorantén izomerekre vonatkozóan. Ezek az izomerek 5%-os fenilmetil-szilikon vagy "X-5" típusú fázison nem választhatók szét.

1. ábra. A paprikából származó PAH-ok esetében alkalmazott mintaextrakciós eljárás.

2. ábra. Tisztítási eljárás EZ-POP NP SPE használatával paprikakivonathoz.

3. ábra. Benzo [b], [k] és [j] fluorantének GC/MS/MS analízise SLB®-PAH MS oszlopokon; 10 ppb paprika kivonatban.

4. ábra. Az extrakciós oldószer hatása az 5 és 6 gyűrűs PAH-ok visszanyerésére a szúrós paprikából (10 ng/g).

2. táblázat GC elemzési feltételek

oszlop	SLB ®-PAHms, 30 m x 0,25 mm belső átmérőjű, 0.25 µm (28340-U)
sütő	60 °C (1 perc), 40 °C/min 180 °C-ig, 3 °C/min 230 °C-ig, 1.5 °C/perc 235 °C-ra (10 perc), 15 °C/perc 280 °C-ra (3 perc), 15 °C/perc 350 °C-ra (15 perc)
inj. hőmérséklet	300 °C
hordozógáz	hélium, 0.8 ml/min, állandó
detektor	MRM, az 1. táblázat szerint
MS forrás temp.	250 °C
Quadrupol hőmérsékletek	200 °C (Q1 & Q2)
injekció	1 µL, impulzus splitless (60 psi, amíg 0.75 percig, osztó bekapcsolva 0,75 percnél)

A mintaelőkészítési eljárás optimalizálása

A mintaextrakciót a "QuEChERS-  -szerű" megközelítés alapján végeztük. Az extrakciós oldószer összetételét a QuEChERS esetében általában használt 100%-os acetonitriltól  a nehezebb PAH-ok visszanyerésének növelése érdekében optimalizáltuk.

A 4. ábra a paprikából nyert, 10 ng/g mennyiségben szúrós paprikából nyert nehezebb 5 6 gyűrűs PAH-ok abszolút válaszának összehasonlítását mutatja be, amelyeket 100%-os acetonitrillel és 90:10 arányú acetonitril:metilén-klorid keverékkel extraháltak. Az így kapott kivonatokat SPE tisztítás előtt elemeztük, hogy csak az extrakciós oldószer hatását értékeljük.

Az 5&6 gyűrűs PAH-ok jobb visszanyerést mutattak a 90:10 arányú keverék használatával, amit a magasabb válaszok is jeleznek. Ahogyan az várható volt, a 90:10 arányú keverékkel előállított extraktumban több volt a háttér, ami olajos maradékként volt látható. Emiatt az extrakciós oldószerben lévő metilén-klorid nagyobb százalékát nem értékeltük.

A tisztítás tekintetében az EZ-POP NP SPE patron jobb tisztítást biztosított, mint a QuEChERS. Az EZ-POP NP patront eredetileg az étolajokból, különösen az olívaolajból származó PAH-ok elemzésére fejlesztették ki. Az étolajmintákhoz ajánlott eluáló oldószer az acetonitril, mivel egyensúlyt biztosít az analit visszanyerése és a háttérvisszatartás között. Korábbi munkák azt mutatták, hogy a metilén-klorid hozzáadása növelte a PAH-ok visszanyerését, de nemkívánatos mellékhatása volt, hogy növelte a háttér mennyiségét a végső kivonatban.⁴ Mivel azonban a paprika oldószeres kivonata lényegesen kevesebb olajat tartalmazott, a tisztítási eljárást módosítani lehetett az 5 és 6 gyűrűs PAH-ok visszanyerésének növelése érdekében anélkül, hogy a háttér elfogadhatatlan szintre emelkedett volna. Konkrétan az elúciós oldószer összetételét úgy változtattuk meg, hogy az metilén-kloridot tartalmazzon. Az 5. ábra a 4-6 gyűrűs PAH-okra kapott abszolút válasz összehasonlítását mutatja a különböző elúciós oldószerek használatával az EZ-POP NP tisztítás során. A feldolgozott minták paprika (10 ng/g spiking szint) voltak, amelyet 90:10 acetonitril:metilén-klorid arányban extraháltak. Az összes PAH-anyag reakciója nőtt a metilén-klorid elúciós oldószerhez való hozzáadásával. A 10 és 20%-os hozzáadás közötti különbség a válaszok között néhány vegyület esetében minimális volt; a végső extraktumban azonban nőtt a háttér. Így a 90:10 arányú acetonitril:metilén-klorid elúciós oldószert választottuk az EZ-POP NP tisztításhoz.

5. ábra. Az EZ-POP NP tisztítás során használt elúciós oldószer összetételének hatása a 4-6 gyűrűs PAH-ok visszanyerésére a szúrós paprikából (10 ng/g).

6. ábra. EZ-POP NP SPE és QuEChERS segítségével tisztított paprikaextraktumok hasonló szorbiensekkel. A Z-Sep, Z-Sep/C18 és Z-Sep+ QuEChERS tisztítások.

7. ábra. A paprikakivonatok GC/MS vizsgálatának összehasonlítása; EZ-POP NP, QuEChERS Z-Sep+ és tisztítás nélkül.

8. ábra. A PAH-ok GC/MS/MS elemzése paprikában, 10 ng/g koncentrációban, EZ-POP NP-vel történő tisztítás után. A csúcsok azonosítóit az 1. táblázat tartalmazza.

Háttércsökkentés

A száraz minták, például a paprika esetében a laza szorbensekkel végzett QuEChERS-tisztítás nem biztosít elegendő kapacitást a háttér elfogadható szintre történő csökkentéséhez. Ha az elemzés peszticidekre irányul, a tisztításhoz szén és primer szekunder amin (PSA) vagy aminopropil-funkcionalizált szilícium-dioxidot tartalmazó kétrétegű SPE-kazetták használhatók. PAH-ok esetében azonban a szén nem használható, mivel erősen visszatartja ezeket a vegyületeket, ami gyenge visszanyerést eredményez. Az EZ-POP NP nem tartalmaz szenet, ezért alkalmas a PAH-ok tisztítására. Tisztítási kapacitását közvetlenül összehasonlítottuk a QuEChERS-sel, amely az EZ-POP NP patronhoz hasonló szorbenseket tartalmazó keverékeket használt. A 90:10 acetonitril:metilén-klorid arányban előállított és az EZ-POP NP és a QuEChERS segítségével tisztított paprikakivonatokat a 6. ábra mutatja. A tisztítás nélkülivel összehasonlítva mindkét módszer csökkentette a színt, az EZ-POP NP-vel a legvilágosabb színt. A Z-Sep-pel tisztított minta némi olajos maradványt mutatott, amint az az üveg belsejében látható. A GC/MS-vizsgálat összehasonlításakor (7. ábra) az EZ-POP NP tisztítás eredményezte a legalacsonyabb hátteret, különösen a C16 és C18 zsírsavak eltávolítása tekintetében. Itt csak a Z-Sep+ adatait mutatjuk be, mivel az összehasonlításba bevont három QuEChERS-szorbens közül ennek volt a legalacsonyabb a háttere. Az EZ-POP NP-vel végzett végleges, optimalizált tisztítási módszerrel az összes PAH-t háttérmentesen detektáltuk, amint az a 8. ábrán látható.

PAH-tüskék visszanyerése és ismeretlen minták elemzése

A 10 ng/g-os tüskével szúrt paprikaminták elemzésének visszanyerési és reprodukálhatósági adatait a 3. táblázat mutatja be. Minden visszanyerési értéket belső standard korrekció nélkül határoztunk meg, így azok abszolút értékek. Összességében a visszanyerés nagyon jó volt (>70%), az RSD-értékek <15%-osak voltak. Kivételt képezett a fluorén és a dibenzo[a,h]pirén. A fluorén-csúcsnál némi mátrixinterferencia eluálódott (mindkét megfigyelt MRM-ben jelen volt), a dibenzo[a,h]pirén esetében pedig a válasz a tüskékből való kioldódáskor rendszertelen volt, ami rossz reprodukálhatóságot eredményezett.

3. táblázat A paprikából származó PAH-ok visszanyerése és reprodukálhatósága, 10 ng/g spiking szint (n = 3)

n=3	avg. % visszanyerés	% RSD
Naftalin	124%	11%
Acenaftén	78%	13%
Acenaftilén	76%	15%
Fluorén	52%	27%/td>
Fenantrén	102%	4%
Antrakén	78%	12%
Fluorantén	95%	7%
Pirén	100%	3%
Benz[a]antracén		99%	9%
Cyclopenta[c,d]pirén	70%	12%
Kriczén	99%	6%
5-metil-kriczén	91%	10%
Benzo[b]fluorantén	89%	6%
Benzo[k]fluorantén	82%	6%
Benzo[j]fluorantén		97%	8%
Benzo[a]pirén	91%	12%
Dibenz[a,h]antracén	84%	6%
Indeno[1,2,3-cd]pirén	86%	12%
Benzo[g,h,i]perilén	80%	5%
Dibenzo[a,l]pirén	108%		12%
Dibenzo[a,e]pirén	82%	5%
Dibenzo[a,i]pirén	108%	15%
Dibenzo[a,h]pirén	147%	36%

A tüskék visszanyeréséhez használt paprikán kívül még két másik márkát elemeztek tüske nélkül. Az egyiket "füstölt paprikaként" jelölték, és így várhatóan lényegesen magasabb PAH-szintet tartalmazott. Mindkét márkát két példányban elemezték, és az eredményeket a 4. táblázat foglalja össze. Az "A" márkában több PAH-t mutattak ki, de egyik sem haladta meg a fűszernövényekre és fűszerekre vonatkozó uniós határértékeket. A füstölt minta ezzel szemben mind a négy, az uniós rendeletben felsorolt PAH-nak kimutatható szintjét tartalmazta. A benzo[a]pirén a megengedett 10 ng/g-os határérték alatt volt jelen; azonban e PAH, valamint a benzo[a]antracén, a krizén és a benzo[b]fluorantén együttes szintje jóval az 50 ng/g-os határérték felett volt. Ez várható volt, mivel a füstölési folyamat során PAH-ok keletkeznek, amelyek később a paprikába kerülnek. Az uniós rendelet azonban kifejezetten kimondja, hogy mivel a füstölt fűszernövényeket általában ilyen kis mennyiségben fogyasztják, mentesülnek e szabályozási határértékek alól.

4. táblázat Paprika elemzése nem szennyezett mintákban (% RPD = % reprodukálhatóság)

	Brand A		Brand B*
n=2	Conc. (ng/g)	%RPD	Conc. (ng/g)	%RPD
Naftalin	69.8	5%	302	3%
Acenaftén	3.0	10%	211.6	1%
Acenaftilén	ND		27.7	4%
Fluorene	ND		272.2	6%
Fenantrén	25.1	2%	2833	56%
Antrakén	ND			677	4%
Fluorantén	ND		995	8%
Pirén	ND			884	7%
Benz[a]antracén	ND		177.6	7%
Cyclopenta[c,d]pirén	7.1	1%	99	7%
Chryzen	ND		103.1		8%
5-Metil-krízol	ND		0.6	25%
Benzo[b]fluorantén	ND		10.8		5%
Benzo[k]fluorantén	ND		ND<
Benzo[j]fluorantén	ND		6.4	5%
Benzo[a]pirén	ND		8.3	6%
Dibenz[a,h]antracén	ND		ND
Indeno[1,2,3-cd]pirén	ND		2.3	2%
Benzo[g,h,i]perilén	ND		2.6		5%
Dibenzo[a,l]pirén	ND		ND
Dibenzo[a,e]pirén	ND		ND
Dibenzo[a,i]pirén	ND		ND
Dibenzo[a,h]pirén	ND		ND

*füstölt paprika

 

A nehezebb PAH-okat nehéz lehet alacsony koncentrációban GC/MS-sel elemezni a válaszadással és a csúcs alakjával kapcsolatos problémák miatt. A műszer teljesítménye gyorsan csökkenhet a szennyezett minták befecskendezésével. Annak megállapítására, hogy ez a paprikakivonatok elemzésénél előfordul-e, a 4-6 gyűrűből származó, nem célzott PAH-ok belső standardjait adtuk a kivonatokhoz az elemzés előtt. Ezeknek a vegyületeknek a reakcióját ezután a futtatás során nyomon követtük. A belső standardok egyikénél sem figyeltek meg csökkenést a reakcióban, és a területszámok eltérése a futás során mindegyiknél <15% volt. Ez azt jelzi, hogy a tisztítás megfelelő volt egy robusztus GC-módszer előállításához.

Következtetések

Mintakészítési módszert dolgoztunk ki a paprikaporban lévő PAH-ok alacsony szintű analízisére. Az extrakciós protokoll egy "módosított QuEChERS" megközelítést alkalmazott, amelyben az extrakciós oldószerhez metilén-kloridot adtak a visszanyerés növelése érdekében. A tisztítást SPE-vel, az EZ-POP NP patronnal végezték, az acetonitril elúciós oldószerhez metilén-klorid hozzáadásával. Ez a módosítás a 4-6 gyűrűs PAH-ok >80%-os abszolút visszanyerését eredményezte, a legtöbb esetben < 15%-os RSD értékekkel. Az SPE tisztítás jelentősen csökkentette a háttérszintet a kivonatban, különösen a C16 és C18 zsírsavak esetében, a laza szorbenseket használó QuEChERS tisztításhoz képest. A PAH-ok elemzése egy alkalmazásspecifikus GC oszlopon (SLB^®-PAHms) volt szükséges az MRM alapján nem megkülönböztethető izomer halmazok kromatográfiás feloldásához.

A PAH-standardjaink teljes választékáért látogasson el a SigmaAldrich.com/pahstandards

oldalra

.

Hivatkozások

1. Commission Regulation (EU) 2015/1933 of 27 October 2015 amending Regulation EC/1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in cocoa fibre, banana chips, food supplements, dried herbs and dried spices. Off. J. Eur. Union 2015, L282/11..

2. Rozentale I, Yan Lun A, Zacs D, Bartkevics V. 2018. The occurrence of polycyclic aromatic hydrocarbons in dried herbs and spices. Food Control. 8345-53. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.04.018

3. Monago-Maraña O, Pérez RL, Escandar GM, Muñoz de la Peña A, Galeano-Díaz T. 2016. Combination of Liquid Chromatography with Multivariate Curve Resolution-Alternating Least-Squares (MCR-ALS) in the Quantitation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Present in Paprika Samples. J. Agric. Food Chem.. 64(43):8254-8262. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b03852

4. Stenerson KK, Shimelis O, Halpenny MR, Espenschied K, Ye MM. 2015. Analysis of Polynuclear Aromatic Hydrocarbons in Olive Oil after Solid-Phase Extraction Using a Dual-Layer Sorbent Cartridge Followed by High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection. J. Agric. Food Chem.. 63(20):4933-4939. https://doi.org/10.1021/jf506299f

5. Cabillic, J.; Fallot, C.,Final Report on the Feasibility Study of QuEChERS Extraction and / or Purification for Analysis of PAHs in Biota, AQUAREF Report 2015 - 22 p..

6. Anderson KA, Szelewski MJ, Wilson G, Quimby BD, Hoffman PD. 2015. Modified ion source triple quadrupole mass spectrometer gas chromatograph for polycyclic aromatic hydrocarbon analyses. Journal of Chromatography A. 141989-98. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.09.054