标准PCR实验方案

PCR操作方法

标准聚合酶链式反应 (PCR) 设置包括四个步骤：

1. 向PCR管中添加所需的试剂或预混液和模板。
2. 混合并离心。
   *添加矿物油可防止在无加热盖的热循环仪中蒸发。
3. 按照热循环仪和引物参数扩增。
4. 先后通过琼脂糖凝胶电泳和溴乙锭染色，评估扩增的DNA。

下面将详细介绍这些步骤以及对应的材料和试剂选择要点。以下为使用Taq DNA聚合酶进行的基本PCR方案。

PCR步骤和必要的PCR组分

PCR的反应的故障排除涉及到多个因素。观看此动画，了解如何根据需要选择正确的组分循环条件以帮助实现理想的效果。

关于用于其他聚合酶或进阶PCR技术的更多实验方案，请参见我们PCR技术指南的实验方案章节。

关于标准PCR的介绍等更多信息，请参见我们的PCR基础页面。

试剂：PCR需要哪些试剂？

PCR所用的试剂	推荐产品
Taq DNA 聚合酶	根据用户的偏好选择Taq DNA聚合酶：（参见后文Taq聚合酶表。）
PCR级纯水	PCR试剂级水
稀释至工作浓度的引物	10 μM工作原液足以进行大多数分析。
寡核苷酸	定制寡核苷酸
待扩增的DNA	研究人员自备
专用移液器
热循环仪	各种多孔恒温槽尺寸或规格
无菌过滤器移液管吸头
无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管	Corning®螺纹盖微量离心管
PCR管或板	选择匹配热循环仪的形式：
	单个薄壁200 μL PCR管
	200 µL联排管
	多孔板和封板膜
dNTP混合液	dATP、dCTP、dGTP、dTTP各含10 mM的脱氧核苷酸混合液 *readymixes 已含dNTPs

什么是Taq聚合酶？

Taq DNA聚合酶是一种来自嗜热细菌栖热水生菌的热稳定酶。其在PCR 常用于扩增DNA片段。该酶是重组形式，在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95°C（PCR技术强制要求）而不会显著损失活性。通过SDS-PAGE测定，该酶约为94 kDa，没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性以及5'→3'核酸外切酶活性。每批Taq DNA聚合酶都经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/μL供应，并配有优化的10x反应缓冲液。

标准Taq DNA聚合酶

请根据下表选择适合您反应条件的Taq  DNA聚合酶混合物。可选择有/无氯化镁(MgCl₂)的透明或红色染料配方，预配制readymix，或包含缓冲液和dNTP的预混液。

含MgCl2		单装MgCl2	Readymix
不含染料的透明配方	含有红色染料，供直接上样到凝胶	不含染料的透明配方	含有红色染料，供直接上样到凝胶	不含染料的透明配方
来自栖热水生菌的Taq DNA聚合酶(D1806)	REDTaq® DNA聚合酶 (D4309)	来自栖热水生菌的Taq DNA聚合酶，不含MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ PCR反应混合液 (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR反应混合液 (P4600)

单位定义：在74℃下，一单位可在30分钟内将10 nmol的总脱氧核糖核苷三磷酸酯结合到酸可沉淀的DNA中。

操作步骤：PCR步骤

Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物和MgCl₂浓度的最佳条件取决于所用的系统。可能有必要确定每个单独组分的最佳条件。对于Taq DNA 聚合酶、循环参数和MgCl₂浓度尤其如此。建议滴定酶和MgCl₂以确定最佳效率。

1. 按照表中给出的顺序将试剂添加到适当大小的试管中。（选择合适的反应设置表：标准试剂或预混试剂。）对于大规模反应，应设置不含模板的预混液，并将其等分到反应管中。最后，应将模板添加到适当的管中。
   

标准PCR反应

用量	组分	终浓度
w µL	水
5 µL	10x PCR缓冲液（P2192或P2317）*	1x
1 µL	脱氧核苷酸混合液	200 µM
w µL	正向引物 （通常长度为15-30个碱基）	0.1-0.5 µM
x µL	逆向引物 （通常长度为15-30个碱基）	0.1-0.5 µM
0.5 µL	Taq DNA 聚合酶*	0.05 单位/µL
y µL	模板DNA（通常为10 ng）	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2（仅与缓冲液P2317一起使用）	0.1-0.5 mM
50 µL	总反应物体积

*可组合购买以下缓冲液和Taq 聚合酶：D1806、D4309或D4545

Readymix PCR反应

用量	组分	终浓度
25 µL	Readymix（R2523或P4600）
w µL	正向引物 （通常长度为15-30个碱基）	0.1-0.5 µM
x µL	逆向引物 （通常长度为15-30个碱基）	0.1-0.5 µM
y µL	模板DNA（通常为10 ng）	200 pg/µL
z µL	水
50 µL	总反应物体积

2.轻轻涡旋混合并短暂离心，收集试管底部的所有组分。

说明：如果使用没有加热盖的热循环仪，则向每个试管的顶部添加50 μL矿物油以防止蒸发。

3.扩增扩增参数会随所使用的引物和热循环仪的不同而不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪优化系统。

典型的循环参数

建议进行25-30个循环的扩增

PCR步骤	温度(°C)	时长
变性温度	94 °C	1 min
退火引物	55 °C	2 min
延伸	72 °C	3 min

4.扩增的DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色来评估。

      说明：可以通过单次氯仿提取（1:1）除去矿物油覆盖层，回收水相。

核酸电泳试剂

• 琼脂糖（预制胶、粉末等形式）
• 缓冲液，例如MOPS-EDTA-乙酸钠，tris-acetate-EDTA (TAE) 或tris-borate-EDTA（TBE）
• 凝胶上样溶液和RNA上样缓冲液
• 电泳染料或染料，如溴化乙锭

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

标签许可声明

致购买者：许可免责声明

根据美国专利5,804,375、5,994,056、6,171,785、6,214,979、5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787和6,258,569，以及美国以外相应的专利、或者任何其他与5' 核酸酶和dsDNA结合染料工艺相关的专利或专利申请，并未随着售出本产品而转让任何许可。欲悉详情，请联系应用生物系统权利许可主任（Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA）