NHS-酯修饰与氨基标记的寡核苷酸缀合的实验方案

本实验方案用于将NHS-酯修饰，例如TxRd（磺酰罗丹明101-X）（方案对大多数NHS-酯修饰有效），缀合到含有氨基标记（例如5'-氨基-修饰物C6）的寡核苷酸上（图1）。由于TxRd（磺酰罗丹明101-X）和几种其他修饰仅以NHS酯的形式提供，因此它们必须在单独的合成后反应中手动缀合至氨基标记的寡核苷酸。

图 1. 用TxRd（磺酰罗丹明101-X）与5'-氨基-修饰物C6寡核苷酸进行的合成后NHS-酯修饰反应的示例。

寡核苷酸退火实验方案的定义/缩写

• DMSO- 二甲基亚砜
• EtOH- 乙醇
• HCl- 盐酸
• NaCl- 氯化钠
• NaB-四硼酸钠十水合物 (Na₂B₄O_{7 ּ}· 10H₂O)

设备

• 实验室摇床
• 冷冻离心机（Eppendorf™ 5810R或同等产品）
• 冻干机或离心蒸发器（用于非自然晾干）

耗材

• 1 mL注射器
• 20G针头
• 2 mL 离心管
• 50 mL离心管（可选）
• 移液器吸头
• 一次性移液器
• NaB（货号 S9640）
• Milli-Q^® H₂O
• HCl（浓缩）
• 100% EtOH（货号 E7023-4L），–70 °C
• 70% EtOH，–20 °C
• 3M醋酸钠缓冲液（货号S7899-1L）
• NHS-酯修饰选择
• 含有定制序列的5'-氨基-修饰物C6寡核苷酸

方法

缀合过程分为两个主要步骤：1）缀合反应，和2）通过缀合后沉淀去除过量的游离NHS-酯修饰。

尽管HPLC是除去过量的游离NHS-酯修饰和未偶联的寡核苷酸的常规方法，但是其他纯化方法（例如沉淀法）也可能有效。沉淀（见下文）能除去大部分但不是全部剩余的NHS-酯修饰。取决于应用，未缀合的修饰可以是个问题。虽然因为NHS-酯已被缓冲液水解所以它不会进一步反应，但它可能导致背景噪音，从而导致不良的信噪比（如果修饰是染料，例如TxRd（磺酰罗丹明101-X）），或者导致表面负荷密度降低（如果修饰是用来附着的，例如生物素）。此外，未偶联的寡核苷酸也会留下来。

缀合反应

从建议的条件开始，视需要进行优化。 

1. 确保所有试剂在使用前解冻、彻底混合并离心。  
2. 根据表1中的说明，将氨基标记的寡核苷酸溶解在缀合缓冲液（例如NaB pH 8.5）中。最终的寡核苷酸浓度为0.3-0.8 mM。关于制备50 mL 0.091 M NaB缓冲液的步骤，请参见“附加说明”。
3. 将NHS-酯修饰溶解于DMSO中。NHS-酯修饰浓度约为14 mM（由于修饰的分子量不同，该值会有偏差）。关于制备NHS-酯修饰的步骤，请参见“附加说明”。
4. 根据表1中的说明，将建议体积的NHS-酯修饰添加到建议体积的氨基标记的寡核苷酸中。轻轻涡旋试管。所指定的体积适合2 mL管。对于较大规模的反应，则使用多个2 mL试管或50 mL试管。
5. 在室温（约25℃）下摇动试管2小时。适当设置摇床速度以避免溅到管壁上。为了保护染料免被曝光，用铝箔包裹试管。

表1 缀合参考指南。

氨基标记的寡核苷酸数量	NaB缀合缓冲液体积	NHS-酯修饰溶液体积	用于沉淀的EtOH /乙酸钠体积
<30 OD	200 µL	50 µL	1 mL
>30 至 60 OD	600 µL	100 µL	2 mL

缀合后沉淀

缀合后沉淀在2 mL管（更大的反应规模则用50 mL管）中进行。务必保护好染料免被曝光。

1. 按照表1中的说明，将指定体积的EtOH / 3 M醋酸钠（9：1 V/V）溶液加入到缀合反应体积中。涡旋溶液以引发沉淀。EtOH / 3 M醋酸钠溶液应使用无水EtOH新鲜制备（可保存一星期）。
2. 将试管在4 °C离心20min。对于Eppendorf 5810R型离心机，使用3,000 RPM，对于微量离心机，使用13,000 RPM。
3. 用一次性移液器清除上清液。请勿让沉淀物从管底部脱落。
4. 加入500 μL冷的70％ EtOH（-20°C），并小心地沿管底搅拌。请勿涡旋（应保持沉淀物不受干扰）。
5. 使用步骤2中的RPM设置在4°C下离心20分钟。
6. 用一次性移液器清除上清液。
7. 如有必要，进行第二次EtOH清洗（步骤4-6）。
8. 晾干、冻干或离心蒸发。

现在寡核苷酸已经与修饰物缀合，当在应用中需要用时，可将其溶解在水或缓冲液中。

其他说明

制备50 mL 0.091 M NaB缓冲液

1. 将1.735 g NaB溶解于约45 mL Milli-Q H₂O中。
2. 使粉末完全溶解，然后用HCl调节pH至8.5。通过加入50 μL的HCl可降低pH。彻底涡旋溶液，然后移液约25 μL至pH试纸上。请勿将pH试纸直接浸入溶液中。
3. 用Milli-Q H₂O定容至50 mL。再次涡旋溶液。
4. 将溶液等分成1 mL，置于2 mL试管中，直至分完。将试管储存在-20°C下以尽量减少pH值变化。

其他非胺缓冲液可以代替NaB，只要pH不高于8.5（更高的pH将太快地水解NHS-酯）。

制备NHS-酯修饰

NHS-酯修饰是以无水试剂形式供应的，装在气密瓶子里。在加入氨基标记的寡核苷酸缓冲溶液之前，切勿使NHS-酯受潮，否则它们会快速水解。使用无水DMSO或其他溶剂。  

1. NHS-酯修饰应储存在-20°C下。在打开瓶子之前，确保其已在室温下完全解冻（请勿加热解冻）。
2. 将20G针头连接到1 mL注射器的顶端。使用该注射器吸取所需体积的DMSO（每mg NHS-酯修饰固体使用100 μL；取决于具体的修饰，可能需要更多的DMSO）。使用“气球”技术将DMSO原液瓶保存在氮压下，以防水分流失。
3. 将无水DMSO加入到NHS-酯修饰瓶中。轻轻上下移液DMSO，同时冲洗小管侧面，以使粉末溶解。轻轻涡旋瓶子以确保完全溶解。
4. 立即使用修饰溶液（不建议保存）。