Biomolekulární NMR: metody izotopového značení pro studium dynamiky proteinů

Eric D. Watt, J. Patrick Loria

ISOTEC^® Stable Isotopes 2008 - 2010 Catalog

• ¹⁵N-označení
• ¹³C-označení
• Související produkty

Určování struktury proteinů pomocí roztokové NMR spektroskopie se již dlouho spoléhá na rovnoměrné stabilní obohacení izotopů o ¹³C a ¹⁵N, aby se zmírnilo překrývání rezonancí a umožnilo se vícenásobné omezení vzdáleností a úhlů, a to na co největším počtu atomových míst, což usnadňuje výpočet optimálního trojrozměrného strukturního modelu.¹ Optimalizace těchto technik značení v poslední době rozšířila rozsah velikostí proteinů, které lze studovat, zvýšila kvalitu trojrozměrných struktur a zjednodušila analýzu experimentálních dat.² Podobně i obor dynamiky proteinů těží z pokroku v technikách izotopového značení, které vědcům umožnily studovat pohybové vlastnosti stále větších proteinů v širokém rozsahu časových škál a zároveň přesněji popisovat pohyby proteinů. Zlepšení izotopového značení pro dynamiku v mnoha ohledech kopírují zlepšení používaná ve strukturních studiích. Spin-relaxační experimenty určené pro studium dynamiky proteinů však mají své vlastní jedinečné požadavky na značení reziduí, což vyžaduje speciální vývoj technik obohacování izotopů, které jsou pro tyto náročné studie vhodnější.

Potřeba izolovaných spinových systémů v dynamice

Roztoková NMR je výkonná metoda pro charakterizaci pohybů proteinů v širokém rozsahu časových škál pomocí měření relaxačních rychlostí požadovaných jader. Návrh těchto relaxačních experimentů i analýza a interpretace dat se výrazně zjednoduší, pokud lze se zájmovou polohou proteinu zacházet jako s izolovaným spinovým párem. V takových případech není návrh sekvence pulzů nadměrně zatěžován nutností zohledňovat a manipulovat s více nežádoucími koherenčními cestami a získané relaxační rychlosti se jednoduše měří z monoexponenciálních profilů rozpadu intenzit píků. Přítomnost více velkých jednovazbových vazeb však může zbytečně komplikovat experimentální výsledky prostřednictvím víceexponenciálních relaxačních drah a degradace signálu a šumu. Z tohoto důvodu byla velká část práce na značkovacích schématech zaměřena na poskytnutí prostředků k izotopickému značení různých izolovaných spinových párů v proteinech tak, aby jednovazbové skalární (J)  vazby nepředstavovaly experimentální překážku.

¹⁵N-značení

Dosud byla většina dynamických studií prováděna za použití rovnoměrného ¹⁵N-obohacení. ¹⁵N je vhodným cílem pro studium z řady důvodů. Dusík potřebný pro růst buněk lze kontrolovat použitím ¹⁵N obohaceného minimálním množstvím nebo živinami bohatých růstových médií, která jsou snadno dostupná, což umožňuje snadnou přípravu vzorků. Výsledkem rovnoměrného ¹⁵N značení je izolovaný spinový systém (¹H-¹⁵N), který se dobře hodí pro relaxační experimenty. Každá ¹⁵N pozice, ať už v páteři proteinu nebo v postranním řetězci, je oddělena od jiného ¹⁵N atomu nejméně dvěma vazbami. Neexistují tedy žádné ¹J_NN vazby, které by mohly vést ke komplikovanému multiexponenciálnímu relaxačnímu chování, které by bylo obtížné přesně změřit a které by zamlžilo interpretaci souvisejících pohybů.

Nicméně, ¹⁵N obohacení samo o sobě neposkytuje úplný obraz pohybů, které protein podstupuje. Dusík tvoří pouze 1/3 páteře bílkovin a v postranních řetězcích je zastoupen jen řídce u 6 z 20 aminokyselin. Proto s výjimkou několika vybraných pozic (Asn, Gln, His, Trp, Lys a Arg) ¹⁵N relaxační experimenty neumožňují podstatné dynamické pokrytí celého proteinu, které by poskytlo úplný obraz pohybů postranních řetězců a páteře. Zejména amidová relaxace může být relativně necitlivá na pohyby v hydrofobním jádru proteinu. Bylo také zjištěno, že některé pohybové módy páteře proteinu nebudou zjištěny sledováním relaxace v amidových polohách. Nicméně jednoduchost ¹⁵N značení proteinů, existující výkonné experimenty a citlivost dusíku na strukturní, elektrostatické a vodíkové vazebné efekty činí ¹⁵N nezbytnou součástí každé dynamické studie.

¹³C-značení

Na povrchu poskytují experimenty s relaxací uhlíku mnoho dalších možností pro studium molekulární dynamiky pomocí NMR spektroskopie. Množství uhlíku v jednotlivých aminokyselinách poskytuje ještě další sondy dynamiky enzymů. Tyto uhlíky jsou obsaženy jak v páteři, tak v postranních řetězcích, což poskytuje informace o dynamice v celém proteinu. Metylové zbytky, které jsou obvykle pohřbeny v hydrofobním jádře, jsou obzvláště vhodné k tomu, aby poskytly informace o dynamickém příspěvku ke skládání a stabilitě proteinu. Závislost ¹³C chemických posunů, zejména C^α, na sekundární struktuře proteinu je jasněji pochopena než u amidového dusíku, což umožňuje snadnější interpretaci změn chemických posunů získaných z některých spin-relaxačních experimentů.

Bohužel ideální metody značení uhlíku nejsou tak přímočaré jako u dusíku. Velké pokrytí dynamiky bílkovin, které poskytuje značná část uhlíku v bílkovině, je stejnou vlastností, která představuje největší problém pro její studium; velký počet atomů uhlíku znamená, že téměř všechny uhlíky sousedí s jiným atomem uhlíku. Proto jednotně značené ¹³C vzorky proteinů vedou k velkým vazebným ¹³C -¹³C spojkám pro mnoho zbytků, což v mnoha případech ztěžuje nebo znemožňuje přímou interpretaci relaxačních dat. Jedinou pozicí, která netrpí výše uvedenými ¹J_CC vazbami, je methioninová Ce methylová skupina, která je od zbytku proteinu izolována atomem síry. Proto jsou v jednotném ¹³C-značeném proteinu omezené možnosti pro studium dynamiky. Ačkoli mohou být údaje o relaxaci metioninu velmi užitečné, neposkytují takovou úroveň dynamického pokrytí, jakou by bylo možné získat z úplnějšího schématu značení uhlíků. Z tohoto důvodu bylo vyvinuto mnoho metod izotopového značení, které využívají známé metabolické dráhy bakterií.

Jedna z metod, která byla použita k izolaci značení ¹³C, se zaměřila na částečné značení pomocí 15% ¹³C-acetátu, přičemž zbytek tvořil ¹²C.³ Tato metoda vede ke zředění značek ¹³C na dostatečnou úroveň, aby bylo možné provádět relaxační experimenty, avšak se současným snížením poměru signálu k šumu v důsledku sníženého podílu značeného proteinu.

Při použití [3-¹³C] pyruvátu jako jediného zdroje uhlíku, ¹³C značení Leu^δ, Val^γ a Ile^γ lze dosáhnout >90% úrovně inkorporace methylových skupin.⁴ Ještě důležitější je, že značení izotopů není ve velké míře zakódováno do přímo vázaných uhlíků, což umožňuje relaxační měření pro tato rezidua. Pro tyto methylové polohy je tedy pozorováno dobré jednohlukové a monoexponenciální relaxační chování. Stejně jako methionin umožňují tyto zbytky nahlédnout do dynamiky pohybu bílkovin v hydrofobním jádře.

Použití α-ketokyselin také poskytuje nákladově efektivní způsob výroby ¹³C-methylem značených aminokyselin, který je také kompatibilní s vysokými úrovněmi deuterace na jiných uhlíkových místech.^5,6 Deuterace umožňuje provádět dynamické studie na mnohem větších proteinových systémech, než je jinak možné. Další výhodou tohoto přístupu je, že dochází k minimálnímu zakódování ¹³C značek, čímž se minimalizují výše zmíněné problémy.

Použití 1- nebo 2-pozičně značeného glycerolu s auxotrofní buněčnou linií umožnilo střídavé začlenění značek pro většinu uhlíků v celém postranním řetězci proteinu. Obvykle jsou zapotřebí dva vzorky bílkovin, aby se získalo co nejúplnější pokrytí atomových pozic.
7 Aromatické zbytky mohou doplnit údaje získané pro methylové skupiny, protože se obvykle nacházejí i v hydrofobním jádře. Specifické značení v těchto zbytcích je obzvláště důležité vzhledem k silnému J-spojení, jakož i malému rozsahu chemických posunů. Dřívější studie ukázaly, že růst na [2-¹³C]-glycerolu povede k obohacení izotopů na střídavých uhlících ve většině aminokyselin, včetně izolovaných aromatických uhlíků v Phe, Tyr a Trp. Růst na [1,3-¹³C]-glycerolu poskytne opačný vzorec značení. Alternativou je použití [1-¹³C]-glukosy jako jediného zdroje uhlíku. Aromatické kruhy se značí na Phe^δ, Tyr^δ, His^δ2/ε1 a Trp^δ1/ε3.⁸ [1-¹³C]-glukosa je výhodná, protože je nejen cenově dostupnější, ale produkuje vyšší výtěžky bílkovin.

Nedávno se ukázalo, že [1-¹³C]-glukosa také povede k ~45% obohacení methylových zbytků Ala, Val, Leu, Met a Ile oddělených dvěma nebo více vazbami od jiných ¹³C značených atomů.⁹ Ve stejné studii se ukázalo, že exprese s [2-¹³C]-glukosou jako jediným zdrojem uhlíku vede k 20-45% obohacení na C¹³C]-glukosu.sup>α pozicích bez značených C' míst a pouze se značenými C^β místy Leu, Val a Ile. Toto značení umožňuje provádět relaxační experimenty CPMG na pozicích C^α a poskytuje tak množství dat, která doplňují data získaná pro běžnější ¹⁵N experiment CPMG.

Nakonec lze izotopové značky začlenit zcela specificky zavedením požadované značené aminokyseliny přímo do růstového média.^10,11 Obvykle se požadovaná aminokyselina, aby se zabránilo zakódování a zředění značky, zahrne do směsi obsahující všechny ostatní aminokyseliny v neznačené formě. Růst buněk je tak díky živinám bohatému růstovému médiu poměrně robustní. Je zřejmé, že v závislosti na poloze požadované značky nemusí být syntéza jednoduchá a může být poměrně časově náročná. Tato technika se osvědčila v dynamických a strukturních studiích a v poslední době se používá při NMR určování struktury velkých proteinů.²

Perspektivy do budoucna

Jak se bude využívat stále více bakteriálních metabolických cest, které umožňují specifické izotopové značení, budou se vyvíjet roztokové NMR relaxační experimenty, které budou moci využít těchto pokroků, což umožní mimořádně podrobný popis dynamiky proteinů v širokém rozsahu typů zbytků.

Odkazy

1. Muchmore DC, McIntosh LP, Russell CB, Anderson DE, Dahlquist FW. 1989. [3] Expression and nitrogen-15 labeling of proteins for proton and nitrogen-15 nuclear magnetic resonance.44-73. https://doi.org/10.1016/0076-6879(89)77005-1

2. Kainosho M, Torizawa T, Iwashita Y, Terauchi T, Mei Ono A, Güntert P. 2006. Optimal isotope labelling for NMR protein structure determinations. Nature. 440(7080):52-57. https://doi.org/10.1038/nature04525

3. Wand A, Bieber R, Urbauer J, Mcevoy R, Gan Z. 1995. Carbon Relaxation in Randomly Fractionally 13C-Enriched Proteins. Journal of Magnetic Resonance, Series B. 108(2):173-175. https://doi.org/10.1006/jmrb.1995.1119

4. Lee AL, Urbauer JL, Wand AJ. 1997. 9(4):437-440. https://doi.org/10.1023/a:1018311013338

5. Gardner KH, Kay LE. 1997. Production and Incorporation of15N,13C,2H (1H-?1 Methyl) Isoleucine into Proteins for Multidimensional NMR Studies. J. Am. Chem. Soc.. 119(32):7599-7600. https://doi.org/10.1021/ja9706514

6. Goto NK, Gardner KH, Mueller GA, Willis RC, Kay LE. 1999. 13(4):369-374. https://doi.org/10.1023/a:1008393201236

7. LeMaster DM, Kushlan DM. 1996. Dynamical Mapping ofE. coliThioredoxin via13C NMR Relaxation Analysis. J. Am. Chem. Soc.. 118(39):9255-9264. https://doi.org/10.1021/ja960877r

8. Teilum K, Brath U, Lundström P, Akke M. 2006. Biosynthetic13C Labeling of Aromatic Side Chains in Proteins for NMR Relaxation Measurements. J. Am. Chem. Soc.. 128(8):2506-2507. https://doi.org/10.1021/ja055660o

9. Lundström P, Teilum K, Carstensen T, Bezsonova I, Wiesner S, Hansen DF, Religa TL, Akke M, Kay LE. 2007. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2-13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone C? and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38(3):199-212. https://doi.org/10.1007/s10858-007-9158-6

10. LeMaste D, Cronan J. 1982. Biosynthetic production of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. Journal of Biological Chemistry. 257(3):1224-30.

11. LeMaster DM, Richards FM. 1982. Preparative-scale isolation of isotopically labeled amino acids. Analytical Biochemistry. 122(2):238-247. https://doi.org/10.1016/0003-2697(82)90275-5