Izotopové značení pro NMR spektroskopii biologických pevných látek

Mei Hong

Department of Chemistry, Iowa State University Ames, Iowa

ISOTEC® Stable Isotopes: Products for Solid State NMR, 2010, 6–11

Izotopové značení hraje nezastupitelnou roli při určování struktury proteinů a dalších biomakromolekul pomocí NMR v pevné fázi. Nejenže zvyšuje citlivost NMR, ale umožňuje také místně specifické zkoumání struktur a mezimolekulárních kontaktů. Tento článek podává přehled různých přístupů izotopového značení, které jsou dnes k dispozici pro biologický výzkum NMR v pevné fázi.

Biosyntetické jednotné ¹³C, ¹⁵N značení

Nejjednodušší a nákladově nejefektivnější metodou biosyntetického značení pro NMR v pevné fázi proteinů je rovnoměrné značení všech atomů uhlíku a dusíku pomocí ¹³C a ¹⁵N. Tímto způsobem může jediný vzorek proteinu v zásadě poskytnout všechna strukturní omezení - dihedrální úhly a vzdálenosti - o proteinu. Značenými prekurzory jsou obvykle jednotně (U) ¹³C značená glukóza nebo glycerol a ¹⁵N značený chlorid amonný nebo síran amonný. Tyto sloučeniny lze snadno začlenit do růstových médií pro expresi proteinů. Jednotné značení ¹³C, ¹⁵N se dočkalo nejširšího uplatnění při vývoji nových vícerozměrných korelačních technik s magickým úhlovým rozdělením (MAS) pro úplné určení struktury proteinů. Řada mikrokrystalických proteinů, jejichž struktura je známa z rentgenové krystalografie nebo NMR roztoků, byla použita k demonstraci schopnosti NMR pevného stavu získat de novo trojrozměrné struktury. Mezi tyto mikrokrystalické proteiny patří ubikvitin^1,2, GB1^3,4, thioredoxin⁵ a a-spectrinová SH3 doména⁶. Jednotné značení ¹³C a ¹⁵N bylo také účinně použito při určování struktury proteinů amyloidních fibril, jako je transthyretin<.sup>7, prionový protein HET-s⁸ a lidský prionový protein⁹. Společným rysem proteinů, které lze označit podle tohoto schématu, je, že mají dostatečný strukturní řád v nanometrovém měřítku, aby poskytovaly vysoce rozlišená spektra. Bez této vysoké konformační homogenity a z ní vyplývajícího vysokého spektrálního rozlišení se jednotné značení ¹³C nedoporučuje, protože by způsobilo značné přetížení spektra. Byly vyvinuty různé 2D, 3D^1,10,11 a 4D¹² korelační techniky k rozlišení signálů rovnoměrně ¹³C, ¹⁵N značených proteinů a k určení mezijaderných vzdáleností a dihedrálních úhlů.

Jednotné značení ¹³C a ¹⁵N bylo také použito u několika membránových proteinů, jako jsou draslíkové iontové kanály¹³., sedmimembránové šroubovicové proteiny^14,15, komplexy pro sklízení světla¹⁶, membránově vázané enzymy¹⁷ a bakteriální toxiny¹⁸. Protože membránové proteiny mají obvykle větší konformační poruchu než mikrokrystalické proteiny nebo proteiny tvořící vlákna, je spektrální rozlišení membránových proteinů obecně nižší. Nicméně podrobné strukturní informace o klíčových oblastech těchto membránových proteinů nebo globální topologii membránových proteinů v lipidové dvojvrstvě, jako je například hloubka jejich zasunutí, lze stále získat i při použití rovnoměrně ¹³C, ¹⁵N značených vzorků.

Hlavní spektroskopické problémy spojené s MAS NMR rovnoměrně ¹³C značených proteinů jsou trojího druhu: 1) omezený rozptyl izotropních chemických posunů ¹³C vzhledem k nehomogenním šířkám čar vzorku; 2) skalární vazby ¹³C-¹³C, které přispívají k rozšíření čar; a 3) dipolární zkracovací efekt, který ztěžuje měření dlouhých vzdáleností ¹³C-¹³C v přítomnosti silných jednovazných dipolárních vazeb ¹³C-¹³C. Statická ¹⁵N NMR orientovaných membránových peptidů a proteinů tyto problémy nemá, protože spektrální rozptyl je určen mnohem větším rozsahem anizotropních chemických posunů než rozsahem izotropních chemických posunů, a protože neexistuje žádný¹⁵N-¹⁵N skalární vazba ani žádná významná ¹⁵N-¹⁵N dipolární vazba v proteinech. Jednotné ¹⁵N značení proto přináší jen málo komplikací pro určení orientace membránových proteinů a skutečně se dočkalo plodných aplikací^19,20. Na druhou stranu je zjevně žádoucí zvýšit informační obsah zarovnaných spekter vzorků zahrnutím rozměrů ¹³C . V ¹³C NMR orientovaných membránových proteinů je třeba překonat nové spektroskopické výzvy. Například ¹³C-¹³C dipolární vazby proteinů značených U-¹³C se v těchto statických vzorcích pomocí MAS již dlouho neodstraní. Byly navrženy a na monokrystalových modelových sloučeninách²¹ demonstrovány strategie pro rozpojení ¹³C-¹³C vazeb a pro korelační experimenty ve statickém stavu. Bylo také navrženo náhodné frakční značení ¹³C, které představuje kompromis mezi rozlišením a strukturní informací²².

Biosyntetické selektivní značení ¹³C

Dvě ze tří výše uvedených výzev pro studium U-<<.sup>13C značených proteinů se dobře řeší doplňkovým přístupem selektivního značení ¹³C. Při tomto přístupu se do expresního média pro expresi bílkovin začleňují uhlíkové prekurzory, které obsahují pouze specifická místa značená ¹³C. Tato značená místa jsou známými enzymatickými cestami²³ přeměněna na předvídatelné pozice ve dvaceti aminokyselinách, což vede k selektivně a extenzivně značeným proteinům. Všechny zbytky stejného typu aminokyselin mají stejné značené pozice, ale různé aminokyseliny mají různé značené pozice v důsledku odlišných enzymatických cest.

Dvěma hlavními prokázanými prekurzory jsou [2-¹³C] glycerol, který značí především uhlíky Cα aminokyselin, a [1,3-¹³C] glycerol, který značí ostatní místa přeskočená [2-¹³C] glycerolem. Každý prekurzor má tendenci označovat střídavé uhlíky, čímž se odstraní jakékoli značné skalární vazby ¹³C-¹³C a triviální jednovazné dipolární vazby. Tento přístup selektivního značení byl původně navržen LeMasterem a Kushlanem pro NMR studie roztoků a následně převzat pro NMR pevných látek^24-26. Zdaleka nejdůležitější aplikací selektivního značení ¹³C je extrakce vzdáleností z korelačních spekter ¹³C-¹³C. V zásadě lze využít i jiné prekurzory aminokyselin, například oxaloacetát, a-ketoglutarát a pyruvát, jak již bylo provedeno v NMR roztoku bílkovin. Kromě toho byl pro studium proteinů rostlinných buněčných stěn použit ¹³C-značený oxid uhličitý^27,28.

Reverzní značení: kombinace biosyntetického značení s neznačenými aminokyselinami

Další strategií, jak snížit spektrální zahlcení, aniž by bylo nutné přistoupit ke značení specifickému pro aminokyseliny, je kombinace značeného obecného uhlíkového prekurzoru s neznačenými aminokyselinami, takže bude značena pouze podmnožina typů aminokyselin. Pro strukturní studie membránových proteinů je jednou z verzí této strategie TEASE (ten-aminokyselina-sselektivní-aeextenzivní) protokol značení²⁵. Při tomto přístupu slouží [2-¹³C] glycerol a deset neznačených aminokyselin jako uhlíkaté prekurzory expresního média. Těmito deseti aminokyselinami jsou Glu, Gln, Pro, Arg, Asp, Asn, Met, Thr, Ile a Lys, které jsou produkty cyklu kyseliny citronové. Za normálních okolností cyklus rozděluje ¹³C značky v glukóze nebo glycerolu tak, že v těchto aminokyselinách vznikají frakčně značená místa, takže jejich signály je obtížnější přiřadit ve spektrech NMR než u aminokyselin syntetizovaných cestou glykolýzy. Vzhledem k přibližnému rozlišení hydrofobních a hydrofilních aminokyselin z dráhy glykolýzy oproti cyklu kyseliny citronové by v principu mohl být membránový protein značen TEASE ¹³C, aby se selektivně detekovaly transmembránové segmenty bohaté na hydrofobní zbytky.

Je zřejmé, že tento přístup reverzního značení je velmi flexibilní a lze jej přizpůsobit pro různé aplikace. Například prekurzor značený U-¹³C lze kombinovat s malou sadou neznačených aminokyselin, které jsou v proteinu dominantní. Neznačení těchto typů aminokyselin značně zjednodušuje NMR spektra¹⁴ a nepřináší žádné nevýhody pro expresi proteinu.

Místně specifické značení syntetických peptidů a proteinů

Místně specifické značení ¹³C a ¹⁵.N značení nadále poskytuje bohaté strukturní informace o polypeptidech, které jsou příliš malé na to, aby mohly být rekombinantně exprimovány, nebo o proteinech, které jsou příliš velké na to, aby bylo možné analyzovat rovnoměrně ¹³C značená spektra. U polypeptidů kratších než 40 aminokyselin je chemická syntéza obecně proveditelná, proto lze do syntézy peptidů začlenit ¹³C, ¹⁵N-značené aminokyseliny v jejich chráněných formách pro značení specifické pro dané místo.

Běžnou strategií značení aminokyselin specifických pro dané místo je rozptýlené rovnoměrné ¹³C, ¹⁵N-značení zbytků. Pokud není výtěžnost syntézy peptidů neúnosně nízká, lze kombinací několika vzorků s různými U-¹³C, ¹⁵N značenými zbytky nakonec zmapovat kompletní strukturu polypeptidu, který nás zajímá. Tento přístup byl hojně využíván ke studiu amyloidních peptidů²⁹ a membránových peptidů^30-32. Bylo také použito nestejnoměrné značení ¹³C a ¹⁵N specifických aminokyselinových zbytků. Nejčastěji značenými místy jsou ¹³CO páteře polypeptidu a někdy postranní řetězec ¹⁵N lysinových zbytků. Aplikace obvykle zahrnují měření vzdáleností pomocí heterojaderných REDOR³³ nebo homojaderných ¹³C recoupling³⁴ experimentů.

Protože většina peptidů je syntetizována pomocí chemie na pevné fázi Fmoc, značení aminokyselin specifické pro dané místo vyžaduje aminokyseliny chráněné Fmoc. V případě hydrofobních aminokyselin jsou jejich formy chráněné Fmoc obvykle komerčně dostupné a lze je také snadno syntetizovat z jejich nechráněných forem. Naproti tomu polární aminokyseliny vyžadují ochranu jak páteře, tak postranních řetězců, a jsou tedy nákladnější a obtížněji připravitelné. Zatímco syntéza na pevné fázi s Fmoc je dominantní chemií v syntéze peptidů, syntéza na pevné fázi s t-Boc byla také použita pro zajímavé cíle určení struktury³⁵. Boc chráněné ¹³C, ¹⁵N značené aminokyseliny jsou zatím mnohem méně časté. Proto je žádoucí zvýšit komerční výrobu a dostupnost aminokyselin chráněných t-Boc.

Jiná izotopová značení pro studium makromolekulárních komplexů a chemie proteinů

U velkých makromolekulárních komplexů, jako jsou buněčné stěny rostlin a bakterií, a u membránových proteinů vázaných na ligandy nebo inhibitory je často důležité zvýšit rozmanitost izotopového značení, aby bylo možné měřit mezimolekulární vzdálenosti. Pro tento účel jsou snadno dostupné dva izotopy: ²H a ¹⁹F.¹⁹F je přirozeně stoprocentně hojný a má dlouhou historii inkorporace do aminokyselin^36-38 i nepeptidických molekul, jako jsou lipidy a farmaceutické léky³⁹. Místně specifické značení ²H se nejčastěji používá pro methylové skupiny Ala, Leu a Val a je vynikající sondou dynamiky proteinů^40,41 a DNA⁴². V poslední době se perdeuterace proteinů v kombinaci s jednotným značením ¹³C a ¹⁵N využívá jako prostředek k získání spekter proteinů s vysokým rozlišením, protože perdeuterace odstraňuje ¹H dipolární vazbu jako mechanismus rozšiřování čar. Zpětně vyměněné proteiny mají ¹H spiny pouze na vyměnitelných pozicích, jako jsou amidové hydrogeny a lysinové aminoskupiny. Tyto řídké protony lze použít jako vysoce citlivé detekční jádro. Perdeuterované mikrokrystalické proteiny byly použity ke studiu relaxační dynamiky proteinů a interakcí protein-voda^43-45.

K výrobě ¹³C/¹⁵N/².H trojitě značených rekombinantních proteinů je třeba použít ²H a ¹³C značenou glukózu, která je komerčně dostupná. Hlavním problémem při tomto typu exprese proteinů je, aby buňky snášely tekutou kulturu deuterovanou vodou, což obvykle snižuje výtěžnost exprese proteinů.

Perspektivy do budoucna

Isotopové značení je základním a univerzálním nástrojem pro NMR strukturní biologii. Kreativní značení jader citlivých na NMR (¹³C, ¹⁵N a ²H) v kombinaci se strategickým využitím přirozeně 100% zastoupených jader, jako je např.¹⁹F a ³¹P, může posunout strukturní biologii mnoha nerozpustných makromolekul důležitých v biologii.

Pro budoucí pokrok ve strukturní biologii NMR v pevném stavu bude důležité vyvinout rozmanitější panel izotopicky značených sloučenin a vyrábět stávající sloučeniny na ekonomičtější úrovni. Vzhledem k tomu, že biosynteticky získané ¹³C značené prekurzory jsou všudypřítomné a jejich výroba je relativně jednoduchá, je jednou z budoucích výzev chemická výzva, která spočívá ve výrobě rozmanité řady specificky značených aminokyselin a dalších malých biomolekul s izotopovými značkami v požadovaných polohách.

Odkazy

1. Hong M. 1999. 15(1):1-14. https://doi.org/10.1023/a:1008334204412

2. Igumenova TI, McDermott AE, Zilm KW, Martin RW, Paulson EK, Wand AJ. 2004. Assignments of Carbon NMR Resonances for Microcrystalline Ubiquitin. J. Am. Chem. Soc.. 126(21):6720-6727. https://doi.org/10.1021/ja030547o

3. Franks WT, Zhou DH, Wylie BJ, Money BG, Graesser DT, Frericks HL, Sahota G, Rienstra CM. 2005. Magic-Angle Spinning Solid-State NMR Spectroscopy of the ?1 Immunoglobulin Binding Domain of Protein G (GB1): 15N and13C Chemical Shift Assignments and Conformational Analysis. J. Am. Chem. Soc.. 127(35):12291-12305. https://doi.org/10.1021/ja044497e

4. Chen L, Olsen RA, Elliott DW, Boettcher JM, Zhou DH, Rienstra CM, Mueller LJ. 2006. Constant-Time Through-Bond13C Correlation Spectroscopy for Assigning Protein Resonances with Solid-State NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc.. 128(31):9992-9993. https://doi.org/10.1021/ja062347t

5. Marulanda D, Tasayco ML, Cataldi M, Arriaran V, Polenova T. 2005. Resonance Assignments and Secondary Structure Analysis ofE.coliThioredoxin by Magic Angle Spinning Solid-State NMR Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 109(38):18135-18145. https://doi.org/10.1021/jp052774d

6. Pauli J, Baldus M, vanRossum B, Groot Hd, Oschkinat H. 2001 . Backbone and side-chain 13C and 15N signal assignments of the alpha-spectrin SH3 domain by magic angle spinning solid-state NMR at 17.6 Tesla ChemBioChem. 2 272-281.

7. Jaroniec CP, MacPhee CE, Astrof NS, Dobson CM, Griffin RG. 2002. Molecular conformation of a peptide fragment of transthyretin in an amyloid fibril. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99(26):16748-16753. https://doi.org/10.1073/pnas.252625999

8. Wasmer C, Lange A, Van Melckebeke H, Siemer AB, Riek R, Meier BH. 2008. Amyloid Fibrils of the HET-s(218-289) Prion Form a   Solenoid with a Triangular Hydrophobic Core. Science. 319(5869):1523-1526. https://doi.org/10.1126/science.1151839

9. Helmus JJ, Surewicz K, Nadaud PS, Surewicz WK, Jaroniec CP. 2008. Molecular conformation and dynamics of the Y145Stop variant of human prion protein in amyloid fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105(17):6284-6289. https://doi.org/10.1073/pnas.0711716105

10. Rienstra CM, Hohwy M, Hong M, Griffin RG. 2000. 2D and 3D15N?13C?13C NMR Chemical Shift Correlation Spectroscopy of Solids:  Assignment of MAS Spectra of Peptides. J. Am. Chem. Soc.. 122(44):10979-10990. https://doi.org/10.1021/ja001092v

11. Heise H, Seidel K, Etzkorn M, Becker S, Baldus M. 2005. 3D NMR spectroscopy for resonance assignment and structure elucidation of proteins under MAS: novel pulse schemes and sensitivity considerations. Journal of Magnetic Resonance. 173(1):64-74. https://doi.org/10.1016/j.jmr.2004.11.020

12. Franks WT, Kloepper KD, Wylie BJ, Rienstra CM. 2007. Four-dimensional heteronuclear correlation experiments for chemical shift assignment of solid proteins. J Biomol NMR. 39(2):107-131. https://doi.org/10.1007/s10858-007-9179-1

13. Lange A, Giller K, Hornig S, Martin-Eauclaire M, Pongs O, Becker S, Baldus M. 2006. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR. Nature. 440(7086):959-962. https://doi.org/10.1038/nature04649

14. Etzkorn M, Martell S, Andronesi O, Seidel K, Engelhard M, Baldus M. 2007. Secondary Structure, Dynamics, and Topology of a Seven-Helix Receptor in Native Membranes, Studied by Solid-State NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed.. 46(3):459-462. https://doi.org/10.1002/anie.200602139

15. Shi L, Ahmed MA, Zhang W, Whited G, Brown LS, Ladizhansky V. 2009. Three-Dimensional Solid-State NMR Study of a Seven-Helical Integral Membrane Proton Pump?Structural Insights. Journal of Molecular Biology. 386(4):1078-1093. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2009.01.011

16. Huang L, McDermott AE. 2008. Partial site-specific assignment of a uniformly 13C, 15N enriched membrane protein, light-harvesting complex 1 (LH1), by solid state NMR. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1777(9):1098-1108. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2008.01.006

17. Li Y, Berthold DA, Gennis RB, Rienstra CM. 2008. Chemical shift assignment of the transmembrane helices of DsbB, a 20-kDa integral membrane enzyme, by 3D magic-angle spinning NMR spectroscopy. Protein Sci.. 17(2):199-204. https://doi.org/10.1110/ps.073225008

18. Huster D, Yao X, Jakes K, Hong M. 2002. Conformational changes of colicin Ia channel-forming domain upon membrane binding: a solid-state NMR study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1561(2):159-170. https://doi.org/10.1016/s0005-2736(02)00340-1

19. Marassi FM, Ma C, Gratkowski H, Straus SK, Strebel K, Oblatt-Montal M, Montal M, Opella SJ. 1999. Correlation of the structural and functional domains in the membrane protein Vpu from HIV-1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96(25):14336-14341. https://doi.org/10.1073/pnas.96.25.14336

20. Tian C, Gao PF, Pinto LH, Lamb RA, Cross TA. Initial structural and dynamic characterization of the M2 protein transmembrane and amphipathic helices in lipid bilayers. Protein Science. 12(11):2597-2605. https://doi.org/10.1110/ps.03168503

Odkaz

21. Ishii Y, Tycko R. 2000. Multidimensional Heteronuclear Correlation Spectroscopy of a Uniformly15N- and13C-Labeled Peptide Crystal:  Toward Spectral Resolution, Assignment, and Structure Determination of Oriented Molecules in Solid-State NMR. J. Am. Chem. Soc.. 122(7):1443-1455. https://doi.org/10.1021/ja9915753

22. Filipp FV, Sinha N, Jairam L, Bradley J, Opella SJ. 2009. Labeling strategies for 13C-detected aligned-sample solid-state NMR of proteins. Journal of Magnetic Resonance. 201(2):121-130. https://doi.org/10.1016/j.jmr.2009.08.012

23. Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. 1993. Principles of Biochemistry . 2nd ed. . New York: Worth Publishers .

24. Hong M. 1999. Determination of Multiple ?-Torsion Angles in Proteins by Selective and Extensive 13C Labeling and Two-Dimensional Solid-State NMR. Journal of Magnetic Resonance. 139(2):389-401. https://doi.org/10.1006/jmre.1999.1805

25. Hong M, Jakes K. 1999. 14(1):71-74. https://doi.org/10.1023/a:1008334930603

26. Castellani F, van Rossum B, Diehl A, Schubert M, Rehbein K, Oschkinat H. 2002. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420(6911):99-102. https://doi.org/10.1038/nature01070

27. Cegelski L, Schaefer J. 2005. Glycine Metabolism in Intact Leaves byin Vivo13C and15N Labeling. J. Biol. Chem.. 280(47):39238-39245. https://doi.org/10.1074/jbc.m507053200

28. Cegelski L, Schaefer J. 2006. NMR determination of photorespiration in intact leaves using in vivo 13CO2 labeling. Journal of Magnetic Resonance. 178(1):1-10. https://doi.org/10.1016/j.jmr.2005.10.010

29. Petkova AT, Ishii Y, Balbach JJ, Antzutkin ON, Leapman RD, Delaglio F, Tycko R. 2002. A structural model for Alzheimer's  -amyloid fibrils based on experimental constraints from solid state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99(26):16742-16747. https://doi.org/10.1073/pnas.262663499

30. Cady SD, Mishanina TV, Hong M. 2009. Structure of Amantadine-Bound M2 Transmembrane Peptide of Influenza A in Lipid Bilayers from Magic-Angle-Spinning Solid-State NMR: The Role of Ser31 in Amantadine Binding. Journal of Molecular Biology. 385(4):1127-1141. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2008.11.022

31. Mani R, Cady SD, Tang M, Waring AJ, Lehrer RI, Hong M. 2006. Membrane-dependent oligomeric structure and pore formation of a beta-hairpin antimicrobial peptide in lipid bilayers from solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103(44):16242-16247. https://doi.org/10.1073/pnas.0605079103

32. Tang M, Waring A, Lehrer R, Hong M. 2008. Effects of Guanidinium?Phosphate Hydrogen Bonding on the Membrane-Bound Structure and Activity of an Arginine-Rich Membrane Peptide from Solid-State NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed.. 47(17):3202-3205. https://doi.org/10.1002/anie.200705993

33. Qiang W, Sun Y, Weliky DP. 2009. A strong correlation between fusogenicity and membrane insertion depth of the HIV fusion peptide. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106(36):15314-15319. https://doi.org/10.1073/pnas.0907360106

34. Long JR, Dindot JL, Zebroski H, Kiihne S, Clark RH, Campbell AA, Stayton PS, Drobny GP. 1998. A peptide that inhibits hydroxyapatite growth is in an extended conformation on the crystal surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95(21):12083-12087. https://doi.org/10.1073/pnas.95.21.12083

35. Wu Z, Ericksen B, Tucker K, Lubkowski J, Lu W. 2004. Synthesis and characterization of human alpha-defensins 4-6. J Pept Res. 64(3):118-125. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.2004.00179.x

36. Afonin S, Glaser RW, Berditchevskaia M, Wadhwani P, Gührs K, Möllmann U, Perner A, Ulrich AS. 2003. 4-Fluorophenylglycine as a Label for 19F NMR Structure Analysis of Membrane-Associated Peptides. ChemBioChem. 4(11):1151-1163. https://doi.org/10.1002/cbic.200300568

37. Grage SL, Ulrich AS. 2000. Orientation-Dependent 19F Dipolar Couplings within a Trifluoromethyl Group Are Revealed by Static Multipulse NMR in the Solid State. Journal of Magnetic Resonance. 146(1):81-88. https://doi.org/10.1006/jmre.2000.2127

38. Luo W, Mani R, Hong M. 2007. Side-Chain Conformation of the M2 Transmembrane Peptide Proton Channel of Influenza A Virus from19F Solid-State NMR. J. Phys. Chem. B. 111(36):10825-10832. https://doi.org/10.1021/jp073823k

39. Toke O, Lee Maloy W, Kim SJ, Blazyk J, Schaefer J. 2004. Secondary Structure and Lipid Contact of a Peptide Antibiotic in Phospholipid Bilayers by REDOR. Biophysical Journal. 87(1):662-674. https://doi.org/10.1529/biophysj.103.032706

40. Cady SD, Goodman C, Tatko CD, DeGrado WF, Hong M. 2007. Determining the Orientation of Uniaxially Rotating Membrane Proteins Using Unoriented Samples:  A2H,13C, and15N Solid-State NMR Investigation of the Dynamics and Orientation of a Transmembrane Helical Bundle. J. Am. Chem. Soc.. 129(17):5719-5729. https://doi.org/10.1021/ja070305e

41. Williams JC, McDermott AE. 1995. Dynamics of the Flexible Loop of Triose-Phosphate Isomerase: The Loop Motion Is Not Ligand Gated. Biochemistry. 34(26):8309-8319. https://doi.org/10.1021/bi00026a012

42. Meints GA, Karlsson T, Drobny GP. 2001. Modeling Furanose Ring Dynamics in DNA. J. Am. Chem. Soc.. 123(41):10030-10038. https://doi.org/10.1021/ja010721d

43. Morcombe CR, Gaponenko V, Byrd RA, Zilm KW. 2005. 13C CPMAS Spectroscopy of Deuterated Proteins:  CP Dynamics, Line Shapes, andT1Relaxation. J. Am. Chem. Soc.. 127(1):397-404. https://doi.org/10.1021/ja045581x

44. Akbey Ü, Lange S, Trent Franks W, Linser R, Rehbein K, Diehl A, van Rossum B, Reif B, Oschkinat H. 2010. Optimum levels of exchangeable protons in perdeuterated proteins for proton detection in MAS solid-state NMR spectroscopy. J Biomol NMR. 46(1):67-73. https://doi.org/10.1007/s10858-009-9369-0

45. Lesage A, Emsley L, Penin F, Böckmann A. 2006. Investigation of Dipolar-Mediated Water?Protein Interactions in Microcrystalline Crh by Solid-State NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc.. 128(25):8246-8255. https://doi.org/10.1021/ja060866q