Značení a čištění proteinů pomocí odstředivých filtrů Amicon^® Pro

Komerčně dostupné soupravy pro značení proteinů poskytují výzkumným pracovníkům možnost přizpůsobit si vlastní panely pro detekci imunoanalýz. Protože však mnoho protokolů vyžaduje výměnu pufru před značením protilátek a po něm, jsou pracovní postupy založené na dialýze časově náročné a podléhají značným ztrátám bílkovin v několika bodech přenosu vzorku.

Pro odstranění neinkorporovaných značek v aplikacích značení bílkovin jsou odstředivá zařízení rychlou, pohodlnou alternativou gelové filtrace s vysokou obnovitelností.

 

Značení protilátek v malém měřítku (25 μg - 200 μg) pomocí odstředivého filtru Amicon^® Pro

Výrazně vyšších výtěžků ze značení protilátek lze dosáhnout kombinací kroku značení s krokem čištění v systému vše v jednom Amicon^® Pro. Purifikační systém Amicon^® Pro je přizpůsobitelné odstředivé zařízení spojující afinitní purifikaci s následnou koncentrací vzorku a výměnou pufru.

Dvě vlastnosti zařízení Amicon^® Pro z něj činí vhodné zařízení pro přípravu čistých, značených protilátek:

1. První je, že zařízení umožňuje vysoce účinnou výměnu pufru prostřednictvím diafiltrace se současnou koncentrací vzorku během jediného 15minutového odstřeďování.
2. Druhé, celý pracovní postup lze provést v rámci jediného zařízení, což snižuje možnost ztráty vzorku.

Podrobné informace o aplikaci Amicon^® Pro Antibody Labeling naleznete na naší speciální stránce Antibody Labeling a také v naší publikaci (Přečtěte si náš článek z roku 2015 v časopise Journal of Immunological Methods)

Přečtěte si níže stručný přehled protokolu pro použití zařízení Amicon^® Pro pro značení protilátek v malém měřítku.

POZNÁMKA: Všechny kroky, s výjimkou vazebných reakcí, jsou založeny na spinu. Pro všechny kroky s výjimkou reverzního spinu je vyžadován rotor s výkyvným kbelíkem.

Volitelné: Předem navlhčete zařízení pomocí 0,5 ml TBS-T. Roztočte při 1000 x g po dobu 1 min.

1. Vložte roztok protilátek do zařízení Amicon^® Pro následujícím způsobem:
   Pro zředěné protilátky (< 1 mg/ml) připojte zařízení Amicon^® Ultra 0.5 ml filtr (10k MWCO) na základnu zařízení Amicon^® Pro. Vložte protilátku (až 1 ml) do výměnného zařízení. Roztočte 4000 x g po dobu 15 min.
2. Pro koncentrované protilátky (≥ 1 mg/ml) vložte vzorek (až 100 µl) do filtru Amicon^® Ultra 0,5 ml (10k MWCO). Připevněte filtr k základně zařízení Amicon^® Pro.
3. Připravte 1,5 ml reakčního koktejlu obsahujícího barvivo ve vhodném reakčním pufru. Přidejte koktejl do výměnné nádržky.
4. Spřádejte 4000 x g po dobu 15 min.
5. Volitelně: V případě potřeby inkubujte vzorek dalších 30 minut při pokojové teplotě, abyste dosáhli optimální účinnosti značení. Více informací naleznete v naší publikaci.
6. Přidejte do výměnného zásobníku 1,5 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS) ± Na Azid.
7. Spinujte 4000 x g po dobu 15 min pro výměnu pufru a koncentrát.
8. Znovu získejte značenou protilátku z filtru Amicon^® Ultra 0,5 reverzním odstřeďováním.

Výsledky protokolu značení protilátek

Tabulka. Srovnání pracovních postupů biotinylace s ohledem na čas a výtěžnost protilátek.

	Tradiční 0.Odstředivé diafiltrační zařízení o objemu 5 ml	Purifikační systém Amicon® Pro
Čištění vzorku	120 min	15 min
Příprava vzorku	120 min	30 min
Odstranění volného biotinu, výměna pufru, koncentrát	45 min	15 min
Celkový čas protokolu	3.5 hodin	1 hodina
Obnovení antibody	40 %	72 %

Pro porovnání funkční výkonnosti protilátek značených pomocí tradiční centrifugální diafiltrace a pomocí metody Amicon^® Pro byla jejich detekční schopnost porovnána se schopností detekce páru druh/protidruh GAPDH. Při použití podobného množství primární protilátky pro každý blot vykazovaly oba páry biotin/SA stejnou, ne-li o něco lepší citlivost než detekční pár druh/antidruh (obrázek 1).

Obrázek 1.

Pro úspěšnou detekci GAPDH ve Western blotech byla použita biotinylovaná látka Anti-GAPDH pomocí systému Amicon^® Pro. Alikvoty lyzátu buněk A431 stimulovaných EGF (0,25-4 µg) byly rozděleny pomocí SDS-PAGE, přeneseny na membránu Immobilon^®-P a sondovány na β tubulin v systému SNAP i.d.^® 2.0 pomocí různých párů nepřímé detekce. V každém případě bylo použito stejné množství primární protilátky (specifické pro GAPDH).