Řešení problémů s iontoměničovou chromatografií

Obrázek 1. Ideální separace IEX: cílové proteiny dobře rozlišené gradientovou elucí

Pokud jsou v této dobře rozlišené separaci zajímavé pouze některé píky, může být výhodné přejít na krokovou eluci, aby se ušetřil čas a pufr. Zbytek této části je zaměřen na praktické problémy, které mohou vést k neideální separaci IEX.

Obrázek 2. Vzorek se eluuje před zahájením gradientu soli

Zajistěte, aby vyrovnávací paměti byly ve správných kontejnerech. Snižte iontovou sílu vzorku odsolením, strana 156, nebo zředěním startovacím pufrem. U aniontového výměníku zvyšte pH pufru, u kationtového výměníku snižte pH pufru. Pokud se proteiny přesto neváží při žádném pH, je možné, že kolona byla kontaminována detergentem.

Obrázek 3. Vzorek stále eluuje, když začíná gradient

Po aplikaci vzorku se musí stopa UV záření vrátit na základní hodnotu před zahájením eluce, jinak by proteiny, které se nevážou na kolonu, narušovaly separaci. Před zahájením gradientové eluce zvyšte objem startovacího pufru (ekvilibrační krok).

Obrázek 4. Vzorek se eluuje během promývání vysokým obsahem soli

Proteiny se vážou příliš silně. Zkontrolujte, zda jsou pufry ve správných nádobách. Pokud používáte aniontový výměník, snižte pH pufru, pokud používáte kationtový výměník, zvyšte pH pufru.

Zajímavý(é) protein(y) eluuje(jí) pozdě v gradientu

Proteiny se vážou příliš silně. Zvyšte iontovou sílu gradientu. Pokud je pro eluci nutná velmi vysoká koncentrace solí, je vhodnější změnit pH. U aniontového výměníku snižte pH pufru a u kationtového výměníku zvyšte pH pufru. Viz také Tabulka 6.

Zajímavý(é) protein(y) eluuje(jí) příliš brzy v gradientu:

Proteiny se silně neváží. Zkontrolujte iontovou sílu gradientu. Změňte pH, u aniontového výměníku zvyšte pH pufru a u kationtového výměníku snižte pH pufru. Viz také Tabulka 6.

Zajímavé proteiny nejsou dostatečně rozlišeny

Přečtěte si obsah této kapitoly a zkontrolujte klíčové parametry pro zlepšení rozlišení. Viz také Tabulka 6.

Tabulka 6. Řešení problémů.

Situace<./th>	Příčina	Náprava
Snížený nebo žádný průtok sloupem.	Výstup je uzavřen nebo nefungují čerpadla.	Otevřete výstup. Zkontrolujte, zda čerpadla nejeví známky netěsnosti (pokud používáte peristaltické čerpadlo, zkontrolujte také hadičky).
	Zablokovaný filtr, koncovka, adaptér nebo hadičky.	Vyjměte a vyčistěte nebo vyměňte, je-li to možné. Před použitím vždy přefiltrujte vzorky a pufr.
	Vysrážely se lipoproteiny nebo proteinové agregáty.	Odstraňte lipoproteiny a agregáty během přípravy vzorku, (Dodatek 1). Dodržujte postupy čištění, Dodatek 10.
	Srážení bílkovin v koloně.	Úprava podmínek pufru, pH a/nebo solí během běhu pro zachování stability. Postupujte podle postupů čištění, Příloha 10.
	Srážení bílkovin v koloně způsobené odstraněním stabilizačních činidel během separace.	Změňte eluent, aby byla zachována stabilita.
	V koloně došlo k mikrobiálnímu růstu.	Skladujte v přítomnosti 20% ethanolu, abyste zabránili mikrobiálnímu růstu, když se nepoužívá. Pufry vždy filtrujte. Dodržujte postupy čištění, Příloha 10.
Zajímavý pík je špatně rozlišený od ostatních hlavních píků.	Sample aplikován nesprávně.	Zkontrolujte povrch lože a horního filtru kvůli možné kontaminaci.
	Velké směšovací prostory v horní části kolony nebo za ní.	Případně upravte horní adaptér na povrch média. Zmenšete všechny objemy za kolonou.
	Nesprávné pH pufru a/nebo iontová síla.	Zkontrolujte pH a iontovou sílu, abyste se ujistili, že kolona byla po předchozím běhu znovu ekvilibrována. Zkontrolujte požadované podmínky. Připravte nové roztoky.
	Nepříliš optimální podmínky eluce, např. nesprávné pH, příliš strmý gradient, příliš vysoká průtoková rychlost.	Změna elučních podmínek: změna pH, použití mělčího gradientu, snížení průtoku (uvedeno v prioritním pořadí).
	Vzorek je příliš viskózní.	Zřeďte pufrem. Udržujte koncentraci bílkovin pod 50 mg/ml.
	Sloupec je špatně zabalen.	Zkontrolujte účinnost kolony (Příloha 3). V případě potřeby přebalte. Použijte předbalené sloupce.
	Sloupce jsou přetížené.	Snižte zatížení vzorku.
	Vysrážely se lipoproteiny nebo bílkovinné agregáty.	Odstraňte lipoproteiny a agregáty během přípravy vzorku (Dodatek 1).
	Precipitace proteinů v koloně.	Modifikujte podmínky pufru, pH a/nebo soli během běhu, aby byla zachována stabilita.
	V koloně došlo k růstu mikrobů.	Uchovávejte v přítomnosti 20% ethanolu, abyste zabránili růstu mikrobů. Pufry vždy filtrujte. Dodržujte postupy čištění, Příloha 10.
Proteiny se neváží nebo eluují podle očekávání.	Na koloně nebo filtru kolony se vysrážely proteiny nebo lipidy.	Kolonu vyčistěte a vyměňte nebo vyčistěte filtr. Zkontrolujte pH a solnou stabilitu vzorku.
	Vzorek není správně filtrován.	Vyčistěte kolonu, přefiltrujte vzorek a opakujte.
	Vzorek se během skladování změnil.	Připravte čerstvé vzorky.
	Protein může být v elučním pufru nestabilní nebo neaktivní.	Zjistěte pH a solnou stabilitu proteinu.
	Ekvilibrace kolony není úplná.	Zopakujte nebo prodlužte krok ekvilibrace, dokud nebudou vodivost a pH konstantní.
	Nesprávné pH a/nebo iontová síla pufru.	Zkontrolujte požadované podmínky. Připravte nové roztoky.
	Proteiny tvoří agregáty a silně se vážou na médium.	Použijte močovinu nebo zwitteriony, betain do 10 %, taurin do 4 %.
	Podmínky vzorku nebo pufru se liší od předchozích běhů	Zkontrolujte podmínky vzorku a pufru.
	V koloně došlo k mikrobiálnímu růstu	Uchovávejte v přítomnosti 20% etanolu, abyste zabránili mikrobiálnímu růstu, když se nepoužívá. Pufry vždy filtrujte. Dodržujte postupy čištění, Příloha 10.
Protein eluuje později, než se očekávalo, nebo vůbec.	Nesprávné pH pufru.	Zkontrolujte kalibraci pH-metru. Použijte pH pufru bližší pI proteinu.
	Příliš nízká iontová síla.	Zvýšit koncentraci soli v elučním pufru.
	Iontové interakce mezi proteinem a matricí.	Udržovat iontovou sílu pufrů nad 0,05 M.
	Hydrofobní interakce mezi proteinem a matricí.	Snižte koncentraci soli, abyste minimalizovali hydrofobní interakce. Zvyšte pH. Přidejte vhodný detergent nebo organické rozpouštědlo, např. 5% isopropanol.
Protein se eluuje dříve, než se očekávalo (během promývací fáze).	Iontová síla vzorku nebo pufru je příliš vysoká.	Snižte iontovou sílu vzorku nebo pufru.
	Nesprávné podmínky pH.	Zvyšte pH (aniontový výměník). Snižte pH (kationtový výměník).
	Neúplná ekvilibrace kolony.	Zopakujte nebo prodlužte krok ekvilibrace, dokud nebudou vodivost a pH konstantní
Vedoucí nebo velmi zaoblené píky v chromatogramu.	Kanály v koloně.	Přeplňte kolonu pomocí řidší suspenze média. Zkontrolujte balení kolony (Dodatek 3).
	Kolona je přetížená.	Snižte zatížení vzorku a opakujte.
	Kolona znečištěna.	Vyčistěte doporučenými postupy.
Píky jsou na chvostu.	Nesprávné startovací podmínky pufru, vzorek se neváže na kolonu.	Upravte pH. Zkontrolujte koncentraci soli ve startovacím pufru.
	Vzorek je příliš viskózní.	Zřeďte v aplikačním pufru.
	Příliš volné balení kolony.	Zkontrolujte účinnost kolony (dodatek 3). Znovu zabalte při použití vyšší průtokové rychlosti. Použijte předbalené kolony.
Píky mají náběžnou hranu.	Pakování kolony je stlačené.	Zkontrolujte účinnost kolony (dodatek 3). Přebalte s použitím nižšího průtoku. Použijte předbalené kolony.
V eluentu se objevuje médium/kuličky.	Pakování kolony stlačeno.	Zkontrolujte účinnost kolony (dodatek 3). Znovu zabalte při použití pomalejšího průtoku. Použijte předbalené kolony.
	Koncový díl podpěry lože je uvolněný nebo zlomený.	Vyměňte nebo utáhněte.
	Kolona pracuje s příliš vysokým tlakem.	Nepřekračujte doporučený provozní tlak pro médium nebo kolonu.
	Prostředek byl poškozen při balení kolony.	Při vyrovnávání sypkého média nepoužívejte magnetická míchadla
Nízká výtěžnost aktivity, ale normální výtěžnost proteinu.	Protein může být v pufru nestabilní nebo neaktivní.	Zjistěte pH a solnou stabilitu proteinu.
	Enzym oddělený od kofaktoru nebo podobně.	Testujte spojením alikvotů z frakcí a opakováním testu.
Výtěžek proteinu nižší, než se očekávalo.	Protein mohl být rozložen proteázami.	Přidejte inhibitory proteáz do vzorku a pufrů, abyste zabránili proteolytickému štěpení. Proveďte vzorek přes médium, jako je Benzamidine 4 Fast Flow (high sub), abyste odstranili serinové proteázy podobné rypsinu.
	Adsorpce na filtr během přípravy vzorku	Použijte jiný typ filtru.
	Srážení vzorku.	Kontrola pH a solných podmínek, úprava pro zlepšení rozpustnosti vzorku.
	Hydrofobní proteiny.	Přidat denaturační činidla, činidla snižující polaritu nebo detergenty. Přidejte 10% ethylenglykol do běžícího pufru, abyste zabránili hydrofobním interakcím.
	Nespecifická adsorpce.	Snižte koncentraci soli, abyste minimalizovali hydrofobní interakce. Přidejte vhodný detergent nebo organické rozpouštědlo, např. 5% isopropanol. V případě potřeby přidejte do běžícího pufru 10 % ethylenglykolu, abyste zabránili hydrofobním interakcím.
Píky jsou příliš malé.	Vzorek špatně absorbuje při zvolené vlnové délce.	Případně zkontrolujte rozsah absorbance na monitoru. Pokud je vyhovující, použijte jinou vlnovou délku, např. 214 nm místo 280 nm.
	Před a po chromatografickém kroku byly použity různé podmínky stanovení.	Pro všechny testy použijte stejné podmínky analýzy.
	Přílišné rozšíření pásů.	Zkontrolujte balení kolony. V případě potřeby přebalte.
Získává se více vzorku, než se očekávalo.	Protein se snáší s jinými látkami.	Optimalizujte podmínky pro zlepšení rozlišení. Zkontrolujte podmínky pufru použitého pro analýzu před a po provedení testu. Zkontrolujte výběr média.
Získalo se více aktivity, než bylo použito na koloně.	Před a po chromatografickém kroku byly použity různé podmínky testu.	Pro všechny testy použijte stejné podmínky testu.
	Odstranění inhibitorů během separace.
Zdvihnutí protitlaku během běhu nebo během po sobě jdoucích běhů.	Stlačení kolony.	Pokud je to možné, přebalte kolonu nebo použijte novou kolonu. Zkontrolujte přípravu vzorku.
	Mikrobiální růst.	Skladujte v přítomnosti 20% ethanolu, abyste zabránili mikrobiálnímu růstu. Pufry vždy filtrujte. Dodržujte postupy čištění, Dodatek 10.
	Turbidní vzorek.	Zlepšete přípravu vzorku (Dodatek 1). Zlepšete rozpustnost vzorku: přidejte betain (max. 10 % w/v při 25 °C), taurin (max. 4 % w/v při 25 °C, pod pH 8,5) nebo glycerol (1-2 %). U hydrofobních vzorků přidejte ethylenglykol, močovinu, detergenty nebo organická rozpouštědla.
	Srážení bílkovin ve filtru kolony a/nebo v horní části lože.	Čistěte doporučenými metodami. Pokud je to možné, vyměňte nebo vyčistěte filtr nebo použijte novou kolonu. Do provozního pufru zahrňte všechny přísady, které byly použity pro počáteční rozpouštění vzorku.
	Příčinou vysrážení je nesprávné pH.	Kalibrujte pH metr, připravte nové roztoky a zkuste to znovu. Změňte pH.
	Srážení lipoproteinů při zvýšené iontové síle.	Lipoproteiny lze před chromatografií odstranit přidáním 10% dextran sulfátu (konečná hodnota 0,2 %) a 1 M chloridu vápenatého (konečná hodnota 0,5 M).
Vzduchové bubliny v loži. Trhliny v loži.	Pufry nejsou řádně odplyněny.	Důkladně odplyňte pufry.
	Kolona zabalená nebo uložená při nízké teplotě a poté zahřátá.	Odstraňte malé bublinky průchodem odplyněného pufru kolonou. Zvláštní pozornost věnujte použití pufrů po skladování v lednici nebo chladírně. Nedovolte, aby se kolona zahřála vlivem slunečního záření nebo topného systému. Pokud je to možné, přebalte kolonu (dodatek 3).
Trhliny v loži.	Velký únik vzduchu v koloně.	Zkontrolujte těsnost všech spojů. Přebalte kolonu, pokud je to možné (dodatek 3).
Záporné píky na čele rozpouštědla.	Vliv indexu lomu.	Vyměňte vzorek do startovacího pufru.
Neočekávané píky v chromatogramu.	Nečistoty v pufru.	Vyčistěte pufr tak, že jej proženete předkolonou. Použijte vysoce kvalitní činidla.
Píky se objevují na gradientech.	Neúplná eluce předchozího vzorku	Vymyjte kolonu podle doporučených metod pro prázdné vzorky.
Píky v chromatogramu.	Vzduchová bublina zachycená v průtokové cele UV monitoru.	Vždy používejte odplyněné pufry.
UV základní linie stoupá s gradientem.	Tvorba micel při změně koncentrace solí.	Pracujte pod nebo nad kritickou koncentrací micel všech používaných detergentů nebo změňte gradient tak, aby během eluce vzorků nedocházelo k nárůstu UV absorpce.
	Používejte vysoce kvalitní činidla.

*Polární organická rozpouštědla, jako je methanol, ethanol, isopropanol a acetonitril, lze použít v koncentracích 0-20 %, ale nezapomeňte, že některé proteiny mohou v přítomnosti organických rozpouštědel nevratně ztratit svou biologickou aktivitu. Před spuštěním kolony zkontrolujte rozpustnost vzorku a pufru, pH pufru a chemickou stabilitu média.
Upozorňujeme, že při práci s organickými roztoky se může zvýšit protitlak.