Bromid ethylnatý

Co je to ethidium bromid?

Ethidium bromid (EtBr) je fluorescenční barvivo, které se hojně používá v molekulárně biologickém výzkumu. Dříve se používalo jako veterinární trypanocid.¹⁴ Je to mutagenní sloučenina, která interkaluje dvouřetězcovou DNA a RNA.^1,10 Fluorescence EtBr se při vazbě na dvouřetězcovou RNA zvyšuje 21krát, při vazbě na dvouřetězcovou DNA 25krát (ačkoli histony blokují vazbu EtBr na DNA). Ethidiumbromid byl použit v mnoha fluorimetrických testech nukleových kyselin.^15,16,17 Bylo prokázáno, že se váže na jednořetězcovou DNA (i když ne tak silně)² a trojřetězcovou DNA.¹⁸ Vzhledem k vazbě na DNA je EtBr silným inhibitorem DNA polymerázy.⁴

• Prášek pro molekulární biologii (produkt č. 1), který je určen pro molekulární biologii, je silným inhibitorem DNA polymerázy. E7637) je vhodný pro použití při gelové elektroforéze a postupech izolace DNA.
• Vodný roztok (10 mg/ml) (č. výrobku  E1510) je vhodný pro použití při gelové elektroforéze a postupech izolace DNA.
• Vodný roztok pro molekulární biologii (500 mg/ml) (produkt č. E1385) je vhodný pro použití při gelové elektroforéze.

Synonyma: 3,8-diamino-5-ethyl-6-fenylfenantridinium-bromid; 2,7-diamino-10-ethyl-9-fenylfenantridinium-bromid; homidium-bromid; dromilak; EtBr

Podrobnosti o produktu Ethidium bromide

Vzhled: Molekulární vzorec: červený až fialový prášek
: C₂₁H₂₀N₃Br
Molekulová hmotnost: 394,3
Teplota tání: 255-266 °C s rozkladem^1,2

Spektrální údaje:
UV/Vis Absorbance:
Maxima při 210 nm, E^mM = 0.20-0,5; 285 nm, E^mM = 5,0-10,0; 316 nm, E^mM = 50,0; 343 nm, E^mM = 40.0 (voda)³
Zveřejněné absorpční spektrum (methanol) s λ_max při 296 nm a<.br> 525 nm¹
λ_max = 475 nm, E^mM = 5.76 (0,66 M glycinový pufr)⁴

Vliv rozpouštědla na absorbanci:
λmax = 480 nm (voda); 515 (glycerol); 520 nm (metanol): 520 nm (aceton); 532 nm (ethanol); 535 (DMSO) a 540 nm (pyridin).5 Absorpční maximum vzhledem k vodě je po navázání na nukleové kyseliny posunuto do červena k delším vlnovým délkám.6,7

Fluorescence
Excitační/emisní vlnové délky uváděné pro komplex EtBr a nukleové kyseliny:
Ex při 526 nm, Em při 605 nm (ve vodě)8
Ex při 360 nm, Em při 590 nm (v PBS)9
Ex při 525 nm, Em při 600 nm (10 mM TBE, pH 8.0)10
Ex (absorpce) při 510 nm, Em při 590 nm11.

Ex (absorpce) při 482 nm (modrozelená), Em při 616 nm (červenooranžová)12 Výtěžek fluorescence EtBr se zvyšuje s klesající polaritou rozpouštědla.13

Skladování: Pevný prášek vykazoval minimální změny po dvou letech skladování při pokojové teplotě, chráněný před světlem.

Doporučená metoda konečné likvidace je spalování, jak je uvedeno v bezpečnostním listu.23 Bylo prokázáno, že zpracování roztoků prostřednictvím pryskyřice Rohm and Haas Amberlite XAD-16 je účinné až na hranici detekce, přičemž u žádného z kompletně dekontaminovaných roztoků nebyla zjištěna mutagenita.24,25 Nabízíme XAD-16 jako volně ložený produkt a také několik produktů, které adsorbují barvivo pro snadnější likvidaci. Viz kazety Rezorian A161 (č. výrobku  57611 nebo 57610) a Extractor™ pro dekontaminaci EtBr (č. výrobku  57611 nebo 57610). Z361569). Kazetu Rezorian A161 o objemu 5 ml lze použít k ošetření více než 16 litrů roztoku (0,5 mg/litr EtBr) před průnikem barviva. Kazetu s luer lock zámkem lze použít s hadičkami o průměru 4 mm, stříkačkami nebo nízkotlakými chromatografickými systémy. Přístroj Extractor™ pro dekontaminaci EtBr může zpracovat až 10 litrů roztoku (0,5 mg/litr EtBr). Byly navrženy i jiné metody zpracování pro likvidaci vodných roztoků EtBr.26,27,28 Tyto postupy jsme neověřovali a neschvalujeme je.

Související výrobky

Jako alternativní mořidlo byla uvedena methylenová modř (č. výrobku  M4159).19 Homodimer thiazolové oranžové (monomer = č. výrobku  390062) byl zaznamenán jako nemutagenní, ale užitečný pro detekci DNA v agarosových gelech.20

Pro použití v buněčných studiích je možnou alternativou dihydroethidium (č. výrobku  D7008), známé také jako hydroethidin. Jedná se o redukovanou formu barviva, která se uvnitř buňky přeměňuje (dehydrogenuje) na ethidium kationt, jenž pak interkaluje do DNA.21,22

Příprava ethidium bromidu

Při pokojové teplotě se EtBr rozpouští ve vodě v koncentraci 10 mg/ml za vzniku červeného roztoku.2 Měl by být rozpustný až do 20 mg/ml ve vodě nebo až do 2 mg/ml v ethanolu.1 Je rozpustný v 1 dílu v 750 dílech chloroformu.3

Skladové roztoky EtBr ve vodě nebo PBS jsou stabilní nejméně dva roky při pokojové teplotě, pokud jsou chráněny před světlem.11

Barvení elektroforézy ethidium bromidem

Použití při barvení elektroforézy6

1. Barvivo se obvykle zapracovává do gelu a elektroforézního pufru v množství 0,5 mg/ml. Poznámka: Pohyblivost lineární dvouřetězcové DNA při elektroforéze se v přítomnosti barviva snižuje přibližně o 15 %.
2. Pro obarvení po spuštění gelu ponořte gel do elektroforézního pufru nebo vody obsahující EtBr (0,5 mg/ml) na 30-45 minut při pokojové teplotě.
3. Destilace je volitelná. Detekce malých množství (<10 ng) DNA se usnadní, pokud se fluorescence na pozadí způsobená nenavázaným EtBr sníží namočením obarveného gelu do vody nebo 1 mM MgSO4 na 20 minut při pokojové teplotě.

Odkazy

1. Green, F. 1990 . Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators Aldrich Chemical Co . p. 318..

2. Internal quality control - molecular biology laboratories..

3. 1996 . "Merck Index . 12th ed., #4767.

4. Elliott W. 1963. The effects of antimicrobial agents on deoxyribonucleic acid polymerase. 86(3):562-567. https://doi.org/10.1042/bj0860562

5. Olmsted J, Kearns DR. 1977. Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. Biochemistry. 16(16):3647-3654. https://doi.org/10.1021/bi00635a022

6. Sambrook, Jea. 1989 . Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2nd ed, p 6.15, 6.44 . Cold Spring Harbor Laboratory.

7. Le Pecq J. Use of Ethidium Bromide for Separation and Determination of Nucleic Acids of Various Conformational Forms and Measurement of Their Associated Enzymes.41-86. https://doi.org/10.1002/9780470110393.ch2

8. "Bechtol, Kea. December 1994 . American Biotechnology Lab . p. 8.

9. Boer G. 1975. A simplified microassay of DNA and RNA using ethidium bromide. Analytical Biochemistry. 65(1-2):225-231. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90507-2

10. Severini A, Richard Morgan A. 1991. An assay for proteinases and their inhibitors based on DNA/ethidium bromide fluorescence. Analytical Biochemistry. 193(1):83-89. https://doi.org/10.1016/0003-2697(91)90046-v

11. Crary, B, Boyrsenko, M. 1986 . Biotechniques . 4, 98-101.

12. Givan, A. Flow Cytometry: First Principles . p. 104 and p. 64,. Wiley-Liss, NY :

13. 1974 . Methods in Enzymology . 32, 239.

14. Watkins TI. 1952. 585. Trypanocides of the phenanthridine series. Part I. The effect of changing the quaternary grouping in dimidium bromide. J. Chem. Soc..3059. https://doi.org/10.1039/jr9520003059

15. Moore SP, Sutherland BM. 1985. A densitometric nondestructive microassay for DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 144(1):15-19. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90077-6

16. El-Hamalawi AA, Stuart Thompson J, Barker GR. 1975. The fluorometric determination of nucleic acids in pea seeds by use of ethidium bromide complexes. Analytical Biochemistry. 67(2):384-391. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90309-7

17. Karsten U, Wollenberger A. 1977. Improvements in the ethidium bromide method for direct fluorometric estimation of DNA and RNA in cell and tissue homogenates. Analytical Biochemistry. 77(2):464-470. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90259-7

18. Scaria PV, Shafer RH. 1991. Binding of ethidium bromide to a DNA triple helix. Evidence for intercalation.. Journal of Biological Chemistry. 266(9):5417-5423. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)67611-8

19. 1989 . Technique: A Journal of Methods in Cell and Molec. Biol . 1, 183-187 . Philadelphia, PA : Saunders Scientific Publications.

20. Wilke, Wea. 1994 . Mod. Pathol . 7(3):385-387 .

21. Quantitative Fluorescent Microassay for Identification of Antiproliferative Compounds2. https://doi.org/10.1093/jnci/77.6.1235

22. Budd SL, Castilho RF, Nicholls DG. 1997. Mitochondrial membrane potential and hydroethidine-monitored superoxide generation in cultured cerebellar granule cells. 415(1):21-24. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(97)01088-0

23. Corresponding Safety Data Sheet (SDS)..

24. Joshua H. 1986 . Quantitative adsorption of ethidium bromide from aqueous solution by macroreticular resins . BioTechniques . 4 207–208.

25. Lunn G, Sansone EB. 1991. Decontamination of Aqueous Solutions of Biological Stains. Biotechnic & Histochemistry. 66(6):307-315. https://doi.org/10.3109/10520299109109992

26. Lunn G, Sansone EB. 1987. Ethidium bromide: Destruction and decontamination of solutions. Analytical Biochemistry. 162(2):453-458. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90419-2

27. 1992 . Communications from M.A. Armour . University of Alberta, Edmonton, Canada – prior to presentation at First Asian Symposium on Academic Activity for Water Treatment Tokyo";

28. ZOCHER R, BILLICH A, KELLER U, MESSNER P. 1988. Destruction of Ethidium Bromide in Solution by Ozonolysis. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 369(2):1191-1194. https://doi.org/10.1515/bchm3.1988.369.2.1191