Přejít k obsahu
Merck
DomůZnačení a detekce nukleových kyselinMetody značení digoxigeninem (DIG)

Metody značení digoxigeninem (DIG)

Značení digoxigeninem (DIG) a protilátkou proti DIG

Systém DIG je neradioaktivní technologie volby pro značení a detekci nukleových kyselin pro různé aplikace. Systém je založen na steroidu izolovaném z rostlin digitalisu (Digitalis purpurea a Digitalis lanata). Tyto rostliny jsou jediným přírodním zdrojem digoxigeninu, takže protilátka anti-DIG se neváže na jiný biologický materiál, což zajišťuje specifické značení. Díky této vysoké specifičnosti je ve srovnání s radioaktivním značením potřeba méně materiálu, což činí systém DIG ideálním pro nukleovou hybridizační analýzu. Imobilizované nukleové kyseliny se hybridizují se sondou značenou DIG a následná detekce se provádí pomocí vysoce afinitních protilátek proti digoxigeninu, spojených buď s alkalickou fosfatázou (AP), křenovou peroxidázou (HRP), fluoresceinem nebo rhodaminem pro kolorimetrickou a chemiluminiscenční nebo fluorescenční detekci.

Příklad detekce nukleových kyselin značených DIG

Obrázek 1.Příklad detekce nukleových kyselin značených DIG pomocí chemiluminiscenčních substrátů.

Příklad detekce nukleových kyselin značených DIG

Značení DNA pomocí PCR

Značení pomocí PCR je preferovanou metodou přípravy sond značených DIG, pokud je templát k dispozici pouze v omezeném množství, je částečně přečištěný nebo je velmi krátký. Vyžaduje méně optimalizace než jiné metody a poskytuje vysoký výtěžek značené sondy. Při značení PCR termostabilní polymeráza inkorporuje DIG-dUTP při amplifikaci specifické oblasti templátové DNA. Výsledkem je vysoce značená, specifická a extrémně citlivá hybridizační sonda.

Princip reakce

Během standardní reakce PCR se digoxigenin-11-dUTP inkorporuje do nově syntetizované DNA. Jediným předpokladem je, že k syntéze vhodných primerů je zapotřebí určitá informace o sekvenci cílové sekvence. Neradioaktivní systém DIG využívá digoxigenin, steroidní hapten, ke značení DNA, RNA nebo oligonukleotidů pro hybridizaci a následnou barevnou nebo luminiscenční detekci. Digoxigenin je spojen s dUTP prostřednictvím alkalicky značené esterové vazby. Značený dUTP lze snadno inkorporovat enzymatickou syntézou nukleových kyselin pomocí DNA polymeráz. Kombinace neradioaktivního značení s PCR je účinným nástrojem pro analýzu produktů PCR a pro přípravu značených sond z malých množství příslušné cílové sekvence.

Vlastnosti a výhody značení DNA DIG pomocí PCR

Podmínky PCR

  • Před pokusem o inkorporaci DIG optimalizujte parametry amplifikace PCR (podmínky cyklování, koncentrace templátu, sekvence primerů a koncentrace primerů) pro každý templát a sadu primerů v nepřítomnosti DIGdUTP.

Šablona

  • Pro dosažení nejlepších výsledků použijte jako šablonu klonované inzerty. Použití genomické DNA může být obtížnější.
  • Koncentrace šablony je pro úspěšnou výrobu specifických sond klíčová.

Značkování

Při PCR .DIG Probe Synthesis Kit vyžaduje méně optimalizace než většina metod značení, protože obsahuje směs Expand High Fidelity Enzyme Blend. Mezi výhody této enzymové směsi patří:

  • Může efektivně používat jako templát oblasti bohaté na GC
  • Pro většinu templátů nevyžaduje optimalizaci koncentrace MgCl2 a značkovací reakce budou fungovat se standardními koncentracemi 1.5 mM MgCl2

DIG Random Primed DNA Labeling

Metoda "random primed" značení DNA je založena na hybridizaci směsi všech možných hexanukleotidů k templátu DNA. Ve směsi hexanukleotidových primerů jsou zastoupeny všechny kombinace sekvencí, což vede ke statistické vazbě primeru na templátovou DNA. Je tak zaručen stejný stupeň značení po celé délce templátové DNA. Komplementární vlákno se syntetizuje z 3´ OH konců náhodného hexanukleotidového primeru pomocí enzymu Klenow, značení stupně. Modifikované deoxyribonukleosidtrifosfáty ([32P]-, [35S]-, [3H]-, [125I]-, digoxigeninem nebo biotinem značené) přítomné v reakci jsou inkorporovány do nově syntetizovaného komplementárního vlákna DNA.

Tyto značené sondy jsou vhodné zejména pro detekci jedné kopie genu na genomových Southernových blotech, screeningu rekombinantních knihoven, dot/slot blotech a northern blotech. Protože každý primer má jinou šestibázovou sekvenci, produkt značené sondy bude tvořit soubor fragmentů různé délky. Značená sonda se tedy na gelu objeví spíše jako rozmazaný materiál než jako jedinečný pás. Rozložení velikosti značené sondy závisí na délce původního templátu.

Princip reakce

Při náhodném značení Klenowův enzym kopíruje DNA templát v přítomnosti hexamerových primerů a alkalilabilního DIG-11-dUTP. Enzym vkládá v průměru jednu část DIG do každého úseku o délce 20-25 nukleotidů. Výsledný značený produkt je homogenně značená, citlivá hybridizační sonda schopná detekovat pouhých 0,10-0,03 pg cílové DNA.

Nickovo translační značení dsDNA pro In Situ sondy/h2>

Metoda nick translace je založena na schopnosti DNázy I zavádět náhodně rozmístěné zářezy do DNA při nízkých koncentracích enzymu v přítomnosti Mg2+. E. coli DNA polymeráza I syntetizuje DNA komplementární k intaktnímu vláknu ve směru 5´ - 3´ s použitím 3´-OH konců niklu jako primeru. Exonukleolytická aktivita 5´ - 3´ DNA polymerázy I současně odstraňuje nukleotidy ve směru syntézy. Aktivita polymerázy postupně nahrazuje odstraněné nukleotidy izotopově značenými nebo haptenově značenými deoxyribonukleosidtrifosfáty. Při nízké teplotě (+15 °C) je tak neznačená DNA v reakci nahrazena nově syntetizovanou značenou DNA. Pro in situ hybridizační postupy by délka značených fragmentů získaných tímto postupem měla být přibližně 200-500 bází.

Transkripční značení sond RNA

Pro některé aplikace je RNA značená DIG účinnější hybridizační sondou než DNA značená DIG. Například sondy RNA značené DIG mohou detekovat vzácné mRNA v nanogramových množstvích celkové RNA. Tyto označené sondy RNA se vytvářejí in vitro přepisem z předlohy DNA. Při metodě transkripce RNA se DNA klonuje do vícenásobného klonovacího místa transkripčního vektoru mezi promotory pro různé RNA polymerázy (například T7, SP6 nebo T3 RNA polymerázu). Templát je poté linearizován štěpením vektoru v jedinečném místě (v blízkosti inzertu). RNA polymeráza přepisuje vloženou DNA do antisense kopie RNA v přítomnosti směsi ribonukleotidů (včetně DIG-UTP). Během reakce může být DNA přepsána mnohokrát (až stokrát), aby se vytvořilo velké množství kopií RNA plné délky značených DIG (10-20 μg RNA z 1 μg DNA ve standardní reakci). DIG se do RNA začlení přibližně každých 25-30 nukleotidů.

Princip reakce

Templát DNA, který má být přepsán, se klonuje do polylinkového místa vhodného transkripčního vektoru, který obsahuje promotory pro SP6 a nebo T3 a T7 RNA polymerázy. Po linearizaci ve vhodném místě se RNA přepisuje v přítomnosti DIG-11-UTP. Za standardních podmínek se z 1 μg templátu přepisuje přibližně 10 μg RNA značené DIG v plné délce.

Pro úspěšné značení sond RNA jsou rozhodující následující tipy:

RNázy

RNázy jsou všudypřítomné a ke své aktivitě nevyžadují žádné kofaktory. Pokud chcete být úspěšní, proveďte veškerá možná opatření, abyste zabránili kontaminaci RNázami. Například:

  • Doporučuje se používat jednorázové plastové nádobí, skleněné nádobí vypalované v troubě nebo plastové nádobí, které bylo dekontaminováno RNázou ZAP nebo podobnými činidly.
  • Všechny roztoky připravujte s vodou, která byla ošetřena diethylpyrokarbonátem (DEPC) nebo dimethyldikarbonátem (DMDC), a roztoky autoklávujte.
  • Po celou dobu postupu používejte rukavice.
  • Účinnost značení značně závisí na čistotě templátu DNA. Templát by měl být vysoce přečištěný.
  • Konečný templát musí být linearizován, extrahován fenolem/chloroformem a vysrážen etanolem.

Sekvence templátu

  • Některé oblasti primerů a/nebo polylinkerů v templátech DNA jsou homologní s částmi ribozomálních 28s a 18s sekvencí RNA. Značené sondy proto mohou generovat specifické, ale nežádoucí signály ve vzorcích, které obsahují tyto výrazné RNA. Chcete-li tento efekt minimalizovat, odstraňte ze svého templátu co nejvíce polylinkerových sekvencí.
  • Použijete-li k vytvoření templátu DNA PCR, produkt reakce Expand High Fidelity obsahuje některé fragmenty s jedním převisem 3´ A. V případě, že se vám podařilo vytvořit DNA templát, bude produkt reakce Expand High Fidelity obsahovat některé fragmenty s jedním převisem 3´ A. Tento převis může v reakci transkripčního značení vytvářet obalové produkty.

Délka šablony

  • Optimální délka šablony je přibližně 1 kb
  • Minimální délka by měla být alespoň 200 bp

Skladování sondy

  • Pro dlouhodobou stabilitu by měly být sondy RNA alikvotovány a skladovány při -20 °C nebo -70 °C
  • Sondy RNA značené digitálním číslem jsou stabilní nejméně 1 rok při -20 °C nebo -70 °C v ethanolu

Citlivost sondy

  • Pro rychlé stanovení citlivosti antisense RNA sondy značené DIG připravte odpovídající sense RNA (neznačenou) pomocí in vitro transkripce. Poté použijte purifikovaný smyslový transkript v různých koncentracích jako cíl na northern blotu. Z výsledku blotu můžete snadno určit nejnižší množství cíle (smyslového transkriptu), které lze detekovat značenou sondou (antisense transkript).

Oligonukleotid DIG značený 5' koncem, 3' koncem a 3' koncem. Tail Labeling

Pro některé aplikace, jako je hybridizace in situ , je syntetický oligonukleotid značený DIG nejlepší hybridizační sondou. Kromě hybridizace in situ lze oligonukleotidy značené DIG použít jako hybridizační sondy v mnoha aplikacích, včetně dot/slot blotů, screeningu knihoven, detekce opakovaných genových sekvencí na Southernových blotech a detekce hojných mRNA na severních blotech.

Pro značení oligonukleotidů pomocí DIG je k dispozici několik metod, které jsou shrnuty níže.

Značení 5´ konce oligonukleotidu pomocí DIG-NHS-Esteru

Oligonukleotidové značení na 3´ konci pomocí DIG-ddUTP

Přidání 3´ ocásku DIG-dUTP a dATP (přibližně 40-50 zbytků)

Neradioaktivní oligonukleotidové chvosty a detekce

Obrázek 2.Neradioaktivní oligonukleotidové chvosty a detekce.

Odhad výtěžku sondy postupem přímé detekce

Chcete-li přidat správné množství sondy k hybridizaci, musíte nejprve určit množství sondy značené DIG, které vzniklo ve značkovací reakci. Zde uvedený postup přímé detekce porovnává množství značky DIG v sérii ředění připravených ze značené sondy se známou koncentrací kontrolní nukleové kyseliny značené DIG.

Poznámka: Pokud značíte sondu DNA pomocí PCR, nemusíte k vyhodnocení výtěžnosti provádět přímou detekci.

Pro sondy značené pomocí PCR použijte metodu vyhodnocení pomocí gelové elektroforézy.

Přímá detekce zahrnuje následující kroky:

  • Příprava sériových ředění značené sondy a jejich nanesení na nylonovou membránu (potřebný čas: 15 minut)
  • Detekce DIG ve skvrnách pomocí chemiluminiscence; potřebný čas (2-2 hod.5 hodin)

DIG-Related Downloads and Resources

Potřebujete pomoc? Podívejte se na našeho Průvodce výběrem produktů DIG.

Pro více informací si prohlédněte následující brožury:

Podrobné technické informace naleznete v příručkách DIG:

V našich technických tipech se dozvíte, jak zacházet se systémem DIG:

Pouze pro výzkum v oblasti přírodních věd. Není určeno pro použití v diagnostických postupech.

Materiály
Loading
Související články
Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?