Purifikace pomocí glutathionové sepharosy^® High Performance, glutathionové sepharosy^® 4 Fast Flow a glutathionové sepharosy^® 4B

Všechna tato tři chromatografická média se používají k purifikaci rekombinantních proteinů označených GST a dalších S-transferáz nebo glutathion-dependentních proteinů. Umožňují mírné eluční podmínky, které zachovávají strukturu a funkci proteinu. Všechny se dodávají přednabobtnalé ve 20% ethanolu a jsou k dispozici také v různých předbalených formátech, například GSTrap, jak je popsáno dále v této kapitole. Příloha 2 (Characteristics of Glutathione Sepharose products) pro hlavní charakteristiky všech médií glutathionové sepharosy.

V Glutathione Sepharose High Performance je glutathionový ligand spojen s vysoce zesíťovanou 6% agarózou. Médium má průměrnou velikost kuliček 34 µM a lze jej použít pro purifikaci s vysokým rozlišením a eluci koncentrovanějšího vzorku.

V Glutathione Sepharose 4 Fast Flow je glutathionový ligand spojen s vysoce zesíťovanou 4% agarózou. Prostředek má průměrnou velikost kuliček 90 µM. Díky své dobré vazebné kapacitě a flow vlastnostem je vhodnou volbou pro škálování. Toto médium je také vhodné pro dávkové a gravitační purifikace.

V glutathionové sefarose 4B je glutathionový ligand spojen se 4% agarózou. Prostředek má průměrnou velikost kuliček 90 µM. Poskytuje velmi vysokou vazebnou kapacitu a doporučuje se pro purifikaci v malém měřítku i pro dávkové a gravitační operace.

Glutathionová sepharose 4 Fast Flow a glutathionová sepharose 4B jsou k dispozici také předbalené v 96jamkových filtračních destičkách.

Postupy pro dávkovou i kolonovou purifikaci proteinů značených GST jsou uvedeny níže.

Obrázek 5.3. Glutathion Sepharose High Performance, Glutathion Sepharose 4 Fast Flow a Glutathion Sepharose 4B pro purifikaci proteinů značených GST.

Příprava vzorků

Před zahájením tohoto postupu si přečtěte Obecné pokyny pro purifikaci proteinů značených GST.

Přizpůsobte vzorek složení a pH vazebného pufru přídavkem z koncentrovaných zásobních roztoků; zředěním vzorku vazebným pufrem; nebo výměnou pufru.

Propusťte vzorek přes filtr 0,22 µM nebo 0,45 µM a/nebo jej odstřeďte bezprostředně před aplikací vzorku. Pokud je vzorek příliš viskózní, zřeďte jej vazebným pufrem, aby nedošlo k jeho ucpání; zvyšte míru lyzační úpravy (sonikace, homogenizace); nebo přidejte DNázu/RNázu, abyste zmenšili velikost fragmentů nukleové kyseliny.

Příprava pufrů

Používejte vysoce čistou vodu a chemikálie a všechny pufry před použitím filtrujte přes filtr 0,45 µM.

Vazba pufru:	PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.3
Eluční pufr:	50 mM Tris-HCl, 10 mM redukovaného glutathionu, pH 8,0

Ve vazebném a elučním pufru může být obsaženo 1 až 20 mM DTT, aby se snížilo riziko oxidace volných -SH skupin na GST, což může způsobit agregaci značeného cílového proteinu, což vede k nižšímu výtěžku značeného proteinu GST.

Dávková purifikace proteinů značených GST pomocí glutathionové sepharosy HP,  glutathionové sepharosy 4 FF nebo glutathionové sepharosy 4B

Chromatografická média s glutathionovou sepharosou se dodávají přednabobtnalá ve 20% ethanolu. Média se používají při koncentraci finální suspenze 50 %.

1. Určete objem lože glutathionové sepharosy potřebný pro vaši purifikaci.
2. Jemně protřepejte lahvičku, aby se suspenze resuspendovala.
3. Pipetou nebo odměrným válcem odeberte dostatečné množství suspenze pro použití a přeneste ji do vhodné nádoby/zkumavky.
4. Chromatografické médium odstřeďte centrifugací při 500 × g po dobu 5 min. Supernatant opatrně dekantujte.
5. Propláchněte glutathionovou separaci HP, FF nebo 4B přidáním 5 ml PBS na 1 ml suspenze (= 50 % suspenze).

Prostředí s glutathion sefarosou je třeba důkladně propláchnout PBS, aby se odstranil skladovací roztok ethanolu, protože zbytkový ethanol může interferovat s následnými postupy.

6. Chromatografické médium se odstředí při 500 × g po dobu 5 min. Supernatant opatrně dekantujte.
7. Kroky 5 a 6 opakujte jednou, celkem tedy dvakrát promyjte.

Informace o čištění, skladování a manipulaci naleznete v Dodatek 2 (Charakteristiky produktů glutathion-sefarosy).

Purifikace dávkou

1. Přidejte buněčný lyzát do připraveného média glutathionové sepharosy a inkubujte nejméně 30 minut při pokojové teplotě za použití jemného míchání, například otáčením konce na konec.
2. Pomocí pipety nebo válce přeneste směs do vhodné nádoby/zkumavky.
3. Prostředek odstřeďte centrifugací při 500 × g po dobu 5 min. Opatrně dekantujte supernatant
   (= flowthrough) a uschovejte jej pro analýzu SDS-PAGE, abyste zkontrolovali případnou ztrátu nenavázaného cílového proteinu.
4. Propláchněte médium glutathionové separaxe přidáním 5 ml PBS na 1 ml suspenze (= 50 % suspenze). Invertujte a promíchejte.
5. Sedimentujte médium centrifugací při 500 × g po dobu 5 min. Opatrně dekantujte supernatant (= promývací roztok) a uschovejte jej pro analýzu SDS-PAGE.
6. Kroky 4 a 5 opakujte dvakrát, celkem tedy tři promývání.
7. Eluujte navázaný protein přidáním 0,5 ml elučního pufru na 1 ml suspenze glutathionového sefarosového média. Inkubujte při pokojové teplotě po dobu 5 až 10 min za použití jemného míchání, např. otáčením konce na konec.
8. Sedimentujte médium centrifugací při 500 × g po dobu 5 min. Supernatant (= eluovaný protein) opatrně dekantujte a přeneste do čisté zkumavky.
9. Kroky 7 a 8 opakujte dvakrát, celkem tedy tři eluce. Tři eluáty zkontrolujte odděleně, zda neobsahují purifikovaný protein, a eluáty obsahující protein spojte.

Kolonová purifikace proteinů značených GST pomocí glutathionové sepharosy HP,  glutathionové sepharosy 4 FF nebo glutathionové sepharosy 4B

Balení kolony

Podívejte se na pokyny dodávané s výrobky nebo se podívejte na Příloha 6 (Balení a příprava kolon) pro obecné pokyny pro balení kolon.

Purifikace

Pro doporučenou rychlost flokování najdete Dodatek 6 (Balení a příprava kolon), tabulka A6.6.

1. Kolonu ekvilibrujte přibližně 5 objemy vazebného pufru.
2. Předem upravený vzorek aplikujte při nízké rychlosti flow (přibližně jedna třetina rychlosti flow použité během promývání a eluce).
3. Promyjte kolonu 5 až 10 objemy vazebného pufru nebo dokud se ve flowthrough neobjeví žádný materiál. Uložte flowthrough pro analýzu SDS-PAGE, abyste zkontrolovali případnou ztrátu nenavázaného cílového proteinu.
4. Vylučte navázaný protein pomocí 5 až 10 objemů elučního pufru. Frakce shromážděte a zkontrolujte zvlášť, zda se jedná o purifikovaný protein. Spojte frakce obsahující cílový protein značený GST.