Protokol alkalické fosfatázy

Výrobek č.10567752001

Protokol

Defosforylace proteinů

Alkalická fosfatáza (AP) je nespecifická fosfomonoesterhydroláza, která katalyzuje hydrolýzu široké škály organických monofosfátů. Široký výskyt AP v přírodě naznačuje její zapojení do základních biochemických procesů, nicméně neexistují žádné pozitivní důkazy týkající se její fyziologické funkce ani povahy přírodních substrátů. Jako možné funkce ALP byly navrženy hydrolýza fosforesterů, aktivita fosfáttransferázy, aktivita proteinové fosfatázy, transport fosfátů, modulace transportu organických kationtů a zapojení do buněčné proliferace. Alkalická fosfatáza tedy může potenciálně hydrolyzovat i fosfátové skupiny proteinů. Společnost Roche nemá k dispozici žádné specifické údaje a postupy týkající se defosforylace proteinů.

K dispozici jsou dvě publikace, které popisují defosforylaci proteinů pomocí telecí střevní alkalické fosfatázy (CIAP) od společnosti Roche Applied Science:

1. Ahmad a Huang (1981). Defosforylace glykogen syntázy králičího kosterního svalu (fosforylované cyklickou AMP-nezávislou syntázovou kinázou 1) fosfatázami. J. BIOL. CHEM. 256, 757-760.
2. Brugg B, Matus A. J. (1991). Fosforylace určuje vazbu proteinu 2 asociovaného s mikrotubuly (MAP2) na mikrotubuly v živých buňkách. Cell Biol. 114,735-43.
   

Defosforylace pomocí CIAP byla prováděna podle těchto protokolů:

• Z odkazu 1: V reakční směsi obsahující 50 mM pufr Tris-Cl, pH 7. V reakční směsi se používá CIAP, který je v roztoku s molekulou CIAP.5; 1 mM dithiothreitol; 5% glycerol; 5 mM MgCI₂; 0,1 až 0,2 mg/ml fosfoproteinu a 10 U alkalické fosfatázy.
• Z odkazu 2: Fosfoproteiny (5 mg/ml) byly ošetřeny telecí střevní fosfatázou v pufru obsahujícím 0,1 M Tris HCI, pH 8. Fosfoproteiny byly ošetřeny v pufru obsahujícím 0,1 M Tris HCI, pH 8.4, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF, 1 μg/ml pepstatinu, 1 U/ml aprotininu a 0,1 mM ZnCl₂ po dobu 12 hodin při teplotě +37 °C. Z řady testovaných komerčních přípravků pouze ten od společnosti Boehringer Mannheim (Roche Applied Science kat. č. 713 023, 25 U/ml) kombinoval dobrou fosfatázovou aktivitu s nedostatkem detekovatelné proteolytické aktivity. Ve všech experimentech byly použity inhibitory proteáz. Pro dosažení maximální defosforylace byla do reakce každé 3 h přidávána čerstvá fosfatáza na konečnou koncentraci 100 U/ml. Fosfatáza byla následně inaktivována zahříváním po dobu 2 min ve vroucí vodní lázni.

Upozorňujeme, že ne všechna fosforylační místa mohou být přístupná pro defosforylaci pomocí AP (kvůli sterickým překážkám) a že jiné fosfatázy (např, specifické fosfoproteinové fosfatázy nebo kyselé fosfatázy).

Inaktivace

Alkalickou fosfatázu lze obecně inaktivovat teplem: Reakci zahřívejte 10 min při teplotě +65 °C a poté proveďte alespoň jednu extrakci fenol/chloroform/isoamylalkohol (50 : 48 : 2). Inaktivace AP teplem závisí na koncentraci proteinu a koncentraci dvojmocných iontů (Mg²⁺, Zn²⁺) v přípravku. Pro inaktivaci AP molekulárně biologické třídy po defosforylační reakci zahřejte reakci 30 minut při +65 °C v přítomnosti 50 mM EGTA (NE EDTA; EGTA je potřebná k chelataci dvojmocných kationtů), poté extrahujte fenolem a vysrážejte nukleovou kyselinu ethanolem. Množství potřebné EGTA závisí na koncentraci Mg²⁺ v reakční směsi: Pokud reakční směs neobsahuje Mg²⁺ použijte 5 mM EGTA (konečná koncentrace); pokud reakční směs obsahuje 1 mM Mg²⁺ použijte 10 mM EGTA. Pokud je koncentrace AP vyšší než 0,3 U/10 μl, měla by být do inaktivačního postupu vždy zahrnuta extrakce fenolu, aby se zajistilo, že AP nebude interferovat s dalšími kroky. Pokud však čas nebo množství nukleové kyseliny vylučuje srážení etanolem, obvykle postačí k úplné inaktivaci AP delší inkubace (až 45 min) při +65 °C v přítomnosti EGTA. Během tepelného kroku reakční směs každých 10 min krátce odstřeďte (několik sekund), abyste zachytili kapalinu, která zkondenzovala na stěnách zkumavky.

Koncentrace enzymu pro defosforylaci DNA nebo RNA v reakci:

Pro dosažení nejlepších výsledků použijte 0,5 U/50 molů pro 5′ vyčnívající konce [30 min, +37 °C]; - 2.0 U/pmole pro otupení 5′-zapuštěných konců [1 hodina, +50 °C]; - 0,5 U/50 pmole pro RNA s 5′-fosfáty [1 hodina, +50 °C].

Neúspěšná defosforylace

Pokud se daná nukleová kyselina nedefosforyluje za doporučených reakčních podmínek, použijte vyšší koncentraci Mg²⁺ a spermidinu. Pro 5 pmol 5′-fosfátových koncovek rozpusťte nukleovou kyselinu v 10 μl 50 mM Tris-HCl/pH 8,0, obsahující 10 mM MgCl₂, 0,5 mM spermidinu, 0,01 mM EDTA a 0,1 mM ZnSO₄ při pokojové teplotě. Neukládejte na led, protože při ochlazení se komplexy spermidin-DNA srážejí. Přidejte 0,5 U AP (v 1 μl) a inkubujte reakční směs při teplotě +37 °C po dobu 30 minut. Přidejte druhou alikvotní část AP (0,5 U) a inkubujte dalších 30 min. Pro inaktivaci AP zahřejte vzorky 20 min při +68 °C, přidejte 1 μl 0,25 M EGTA (pH 7,8) a inkubujte dalších 20 min při +68 °C. [Během obou kroků zahřívání zkumavky se vzorky po každých 10 min při +68 °C na několik sekund odstřeďte, abyste odstranili kondenzaci ze stěn zkumavky a zabránili vysrážení komplexů spermidin-DNA]

.