Alkalická fosfatáza z telecího střeva (CIP) pro defosforylaci nukleových kyselin

(CIP)
Z telecího střeva

(EC 3.1.3.1)
Produkt č. P4978
Skladujte při -20 °C

Popis produktu
Souhrn produktu
Ukládací vyrovnávací paměť
Procedura: Defosforylace DNA
Tepelná inaktivace
Materiály
Reference

Popis produktu
./span>

CIP se běžně používá k odstranění 5'-fosfátových skupin z DNA, RNA a ribo- i deoxy-ribonukleosid trifosfátů. Odstranění 5'-fosfátů je velmi užitečné při prevenci samoligace štěpených DNA vektorů. Tato vlastnost výrazně snižuje pozadí (plazmidy bez inzertu) při klonovacích postupech.

Souhrn produktu

Aktivita: V případě, že je produkt v roztoku, je třeba jej zkontrolovat, aby byl v roztoku: přibl. 10 000 jednotek/ml (viz etiketa, kde je uvedena aktivita konkrétní šarže)
DNáza: Nezjištěna
Nikáza: Nezjištěno
RNáza: Nezjištěno
Definice jednotky: Jedna jednotka hydrolyzuje 1.0 µmol 4-nitrofenylfosfátu za minutu při pH 9,8 a 37 °C (diethanolamin).

10X CIP pufr (C 3225)
1 M NaCl
0,5 M Tris-HCl pH 7,9 při 25 °C
0,1 M MgCl₂
0.01 M dithiothreitol

Skladovací pufr

10 mM Tris-HCl, pH 8.2
50 mM KCl
1 mM MgCl₂
0.1 mM ZnCl₂
50 % glycerol

Postup: Vezměte si na starost, co je potřeba udělat, abyste se dostali do varu: Defosforylace DNA

1. Rozpusťte DNA v 1X CIP pufru (0,5µg DNA/10 µl).
2. Pro DNA s 5' převisem přidejte 0,1 jednotky/pmol CIP; pro DNA s 3' převisem nebo tupým koncem přidejte 1 jednotku/pmol.
3. Inkubujte 60 minut při 37 °C.
4. Extrahujte fenolem/chloroformem (P3803 nebo P2069) nebo DNA přečistěte gelem.*
5. Znovu získáte DNA srážením alkoholem.
   *Poznámka: Díky extrakci fenolem nebo gelovému čištění není nutná tepelná inaktivace.

Využijte tepelnou inaktivaci.Tepelná inaktivace

Více než 95 % aktivity lze inaktivovat zahřátím na 75 °C po dobu 10 minut v přítomnosti 5 mM EDTA.

Odkazy

1. Moessner E, Boll M, Pfleiderer G. 1980. Purification of Human and Bovine Alkaline Phosphatases by Affinity Chromatography. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 361(1):543-550. https://doi.org/10.1515/bchm2.1980.361.1.543

2. Sambrook, et al. J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.