Protokol o extracelulárních vezikulách

Obohacení extracelulárních vezikul za pouhých 40-60 minut pomocí odstředivých filtrů. Pokud vás odrazují ultracentrifugační nebo precipitační metody přípravy exozomů a dalších extracelulárních vezikul (EV), vyzkoušejte tento rychlý protokol, který předčí metody precipitace exozomů.

Přehled sekcí

• Obohacení frakce mikrovezikul ze supernatantu buněčných kultur pomocí Amiconu^® Ultra Centrifugal Filters
• Krok 1. Clarifikace vzorku
• Krok 2. Vyrovnání zařízení
• Krok 3. Ultrafiltrace vzorku (koncentrace a výměna pufru)
• Související produkty

Obohacení frakce mikrovezikul ze supernatantu buněčných kultur pomocí odstředivých filtrů Amicon^® Ultra

Následující protokol byl navržen pro obohacení extracelulárních vezikul (EV) z médií buněčných kultur bez séra. Postup zahrnuje předběžné vyčištění vzorku (odstranění buněk a zbytků buněk) pomocí vakuové filtrace s použitím zařízení Steriflip^®. Přefiltrovaný vzorek se poté zkoncentruje centrifugací pomocí Amicon^® Ultra (AU) filtru (10 kDa MWCO). Druhé odstřeďování se provádí pro vyčištění vzorku a výměnu pufru pomocí odstředivé diafiltrace. Konečný koncentrovaný vzorek je připraven k následné analýze nebo aplikaci.

Poznámka: Všechny čtyři velikosti filtrů Amicon^® Ultra (0,5 mm) jsou připraveny k filtraci.5, 2, 4 a 15 ml) jsou kompatibilní s tímto pracovním postupem; konkrétní informace týkající se vhodných odstředivek/rotorů a maximálních rychlostí odstřeďování naleznete v každé uživatelské příručce.

Poznámka: Doporučujeme používat média bez séra, aby nedocházelo ke koncentraci příliš velkého množství albuminu, který je přítomen ve fetálním hovězím séru (FBS). Pokud albumin nepředstavuje problém, lze protokol použít i na vzorky obsahující sérum. Pro dosažení podobné koncentrace je třeba prodloužit dobu centrifugace (kroky 9 a 11 níže) kvůli zvýšenému obsahu bílkovin.

Poznámka: FBS obsahuje také exosomy, které mohou interferovat s některými navazujícími analýzami. Média bez exosomů, jako jsou média Exo-FBS™ Exosome depleted (System Biosciences), budou stále obsahovat albumin.

Krok 1. V případě, že je exosomů méně, je třeba provést další krok. Objasnění vzorku

1. Přeneste supernatantní médium z baňky s buněčnou kulturou do 50ml kónické zkumavky se závitem.
2. Zašroubujte jednotku Steriflip^®  (0,22 µm membrána Millipore Express (PES)) do horního otevřeného konce zkumavky se vzorkem. Pevně ji zajistěte.
3. Sestavu invertujte a zajistěte v podstavci pro zkumavky nebo ve stojanu.
4. Připojte regulovaný zdroj vakua k vakuovému portu na boku jednotky Steriflip^®. Zapněte vakuum a nasajte roztok přes membránu do prázdné zkumavky.
5. Sundejte zařízení Steriflip^® a vzorek uzavřete. Přefiltrovaný vzorek skladujte při 4 °C nebo pokračujte v obohacování vezikul.

Popsaný protokol centrifugální ultrafiltrace je založen na zpracování 15 ml vzorku (maximální objem) pomocí Filtru UA-15 (10 kDa MWCO). V případě odlišných objemů nebo formátů zařízení (AU-0) nahlédněte do příslušné příručky uživatele filtru Ultra společnosti Amicon^®.5, -2 nebo -4 ml).

Krok 2. V případě, že je třeba použít zařízení s objemem 1,5 ml, je třeba použít zařízení s objemem 2,5 ml. Vyrovnání zařízení

6. Přidejte do zařízení 2 ml PBS, zakryjte a odstřeďte při 4000 x g po dobu 10 minut v rotoru s výkyvným kbelíkem.

• Pro AU-2 a 4 lze použít stejnou rychlost odstřeďování. Pokud se má použít rotor s pevným úhlem, vyhledejte si v uživatelské příručce k zařízení informace o vhodných omezeních rychlosti a objemu.
• Pro AU-0,5 se vzorky odstřeďují při 14 000 x g v pevném rotoru, do kterého se vejdou zkumavky o objemu 1,5 ml.

7. Odstraňte nefiltrovaný PBS ze dna filtračního zařízení. Aspirujte filtrát ze sběrné zkumavky.

• U zařízení AU-2, 4 a 15 odstraňte filtrát vložením pipetky (p200) do dna filtračního zařízení a odebírejte vzorek pomocí klouzavého pohybu ze strany na stranu, abyste zajistili úplné odstranění.
• U zařízení AU-0,5 odstraňte filtrát zpětným roztočením při 1000 x g po dobu 2 minut. Před dalším postupem odsajte PBS ze sběrné zkumavky nebo připojte čistou mikrocentrifugační zkumavku.

Krok 3. Ultrafiltrace vzorku (koncentrace a výměna pufru)

8. Přidejte 15 ml vzorku do Filtru UA-15 a zařízení uzavřete.
9. Centrifugujte 30 minut při 4000 x g.
   POZNÁMKA: V průměru se takto získá konečný vzorek o objemu 500 µl (30násobná koncentrace). V závislosti na povaze vzorku se však průtoková rychlost, a tedy i doba centrifugace potřebná k dosažení požadované koncentrace, může lišit. Odhady pro zpracování menších objemů naleznete v uživatelských příručkách jednotlivých filtrů Amicon^® Ultra.
10. Vyjměte zařízení z centrifugy a vyprázdněte sběrnou zkumavku.
11. Přidejte 14 ml PBS do filtračního zařízení a jemně několikrát pipetujte vzorek. Odstřeďujte při 4000 x g po dobu 30 minut.
12. Vyjměte koncentrovaný vzorek z filtračního zařízení.

• Pro zařízení AU-2, -4 a-15 vložte pipetku (p200), odeberte objem vzorku (200 µl) a několikrát promyjte boční stěny membrány (3-4 na každé straně), abyste zajistili úplné obnovení. Obnovte objem vzorku ze základny filtračního zařízení
• Pro AU-0,5 umístěte filtr dnem vzhůru do čisté mikrocentrifugační zkumavky. Odstřeďujte při 2 000x g po dobu 1 minuty, abyste vzorek přenesli do zkumavky (reverzní odstřeďování).

13. Vzorek extracelulárních vezikul je připraven k analýze.