Odstraňování detergentů pomocí odstředivých filtrů Amicon^® Pro

Detergenty se často používají k rozpouštění proteinů a nukleových kyselin během purifikace, ale přítomnost detergentů může narušovat následné analýzy. Volné detergenty lze odstranit různými protokoly¹; molekuly detergentů, které jsou nekovalentně vázány na makromolekuly, však lze vytěsnit, ale ne zcela odstranit. Pro většinu následných analýz naštěstí stačí odstranit volný detergent.

Odstředivé filtry Amicon^® Pro jsou účinným nástrojem pro odstranění detergentů z roztoků proteinů nebo nukleových kyselin. Výběr filtru závisí na kritické koncentraci micel (CMC) pro daný detergent. Při koncentracích vyšších než CMC vytvářejí monomery detergentu micelární agregáty s hrubými změnami molekulární struktury. Výběr odstředivého zařízení se správným nominálním limitem molekulové hmotnosti (NMWL) umožňuje účinné odstranění detergentu.

Může však být náročné vybrat ultrafiltrační zařízení s NMWL, které propustí detergenty, ale nikoliv zájmové bílkoviny. Protože mnohé detergenty vytvářejí velké micely, vyžadují pro depleci na základě velikosti použití membrán s NMWL až 100 kDa, což vede ke ztrátě zájmových proteinů ve vzorku. Jedním ze způsobů, jak pro tyto detergenty použít ultrafiltry s menší velikostí pórů, je nejprve snížit tvorbu micel ředěním vzorku.

Pro odstranění detergentů byl použit systém Amicon^® Pro s použitím kontinuální diafiltrace, při níž je konstantní objem vzorku nepřetržitě promýván pufrem bez detergentů. Touto metodou bylo možné odstranit detergenty účinněji a s vyšší výtěžností proteinů než při použití diskontinuální diafiltrace nebo dialýzy. Současné sledování odstraňování detergentů a výtěžnosti proteinů bylo prováděno pomocí infračerveného spektrometru Direct Detect^®.

Další informace o metodách sledování odstraňování detergentů naleznete v naší publikaci, Analýza detergentů ve vzorcích proteinů pomocí spektroskopie ve střední infračervené oblasti (MIR).

Metoda

1. Pokud je to nutné, vyčistěte analyzovaný vzorek pomocí filtru Steriflip^® 0,45 µm nebo filtru Millex^® 0.45 µm stříkačkového filtru.
2. Použijte spektrometr Direct Detect^® k odhadu koncentrace detergentu a proteinu ve výchozím materiálu. Podrobnosti o kalibraci spektrometru pomocí 8bodového ředění zájmového detergentu a "průvodce kalibrací lipidů" v softwaru přístroje naleznete v uživatelské příručce Direct Detect^® a také v naší publikaci.
3. Přidejte 50-100 µl tohoto vzorku do přístroje Amicon^® Ultra 0.5 ml filtru (je součástí systému Amicon^® Pro)
4. Připojte filtr k výměnnému zařízení Amicon^® Pro.
5. Přidejte 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku do sestavy výměnné zařízení/Amicon® Ultra 0,5 ml filtr. Plně sestavte zařízení Amicon^® Pro.
   (Zařízení Amicon^® Pro může bezpečně pojmout až 9 ml pufru. Přidání pouhého 1,0 ml čerstvého pufru však účinně umožní 1000násobnou výměnu pufru, protože díky účinnosti kontinuální diafiltrace je vzorek neustále vystaven čerstvému pufru bez detergentů)
6. Centrifugujte při 4000 x g po dobu 30 minut v rotoru s výkyvným vědrem.
7. Vyjměte a rozeberte zařízení Amicon^® Pro.
8. Vyjměte a rozeberte zařízení Amicon^® Ultra 0.
9. Vyjměte a rozeberte zařízení Amicon^® Pro.5 ml sběrné zkumavky přes horní část filtru Amicon^® Ultra 0,5 ml a invertujte.
10. Znovu získáte vzorek otáčením v rotoru s pevným úhlem při 1000 × g po dobu 2 minut.
11. Použijte spektrometr Direct Detect^® jako v kroku 2 k odhadu koncentrace obnoveného proteinu a k potvrzení vytěsnění detergentu.

Příklad výsledků odstranění detergentu pomocí systému Amicon^® Pro

Odstranění 0,5% deoxycholátu sodného z 2 mg/ml IgG. S použitím 2 mg/ml IgG rozpuštěného v 0,5% deoxycholátu sodném byl použit purifikační systém Amicon^® Pro, aby se ukázalo, že detergent zředěný pod jeho CMC lze snadno odstranit metodou ultrafiltrace na základě velikosti.

Níže uvedený obrázek porovnává odstranění detergentu pomocí kontinuální diafiltrace s postupnými kroky ředění a koncentrace. Kontinuální diafiltrace udržuje koncentraci volného detergentu pod kritickou koncentrací micel (CMC). V důsledku toho se tvoří méně micel než při střídavém ředění a zahušťování a ultrafiltrace je při odstraňování molekul detergentu účinnější.

Kontinuální diafiltrace také zabraňuje příliš rychlému zahušťování proteinu v pufru bez detergentu, což může narušit stabilizační interakce mezi detergentem a proteinem, způsobit vysrážení proteinu a snížit výtěžnost.

Měření odstraňování detergentu a obnovy bílkovin během odstraňování detergentu umožnilo určit protokol, který přináší optimální rovnováhu obou procesů.

Podle výsledků měření bylo možné stanovit, který z protokolů přináší optimální rovnováhu obou procesů.

Detergent byl odstraněn z 50 µl vzorku bílkovin a zároveň bylo sledováno procento odstraněného detergentu (A) a procento získaných bílkovin (B). Šedé sloupce odrážejí výsledky odstranění detergentu pomocí kontinuální diafiltrace s použitím 10x, 20x a 30x objemů pufru bez detergentu, zatímco černé sloupce odrážejí výsledky odstranění detergentu nejprve 10x, 20x nebo 30x zředěním vzorku a následným zahuštěním ultrafiltrací. Všimněte si, že když byl vzorek zředěn pouze 10x, tradiční ultrafiltrační zahuštění neodstranilo ze vzorku žádný detergent (A).

Odkazy

1. Das C, Nadler T, Strug I. 2015. Detergent Analysis in Protein Samples Using Mid?Infrared (MIR) Spectroscopy. Current Protocols in Protein Science. 81(1): https://doi.org/10.1002/0471140864.ps2912s81