Hmotnostní spektrální vypuštění kolony ve stacionárních fázích HPLC s obsahem dusíku v polární vrstvě
Carmen T. Santasania, David S. Bell
Reporter EU Volume 16
Úvod
Kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií se v posledním desetiletí stala jedním z nejdůležitějších nástrojů v laboratoři analytické chemie. Díky strukturním informacím, které lze získat spolu s citlivou detekcí, se tato technika stala nepostradatelnou ve farmacii, životním prostředí a řadě dalších vědních oborů.
HPLC column bleed je hlavním zdrojem signálu pozadí při LC-MS analýzách. K tomuto výtoku dochází, když se během analýzy z kolony eluuje vázaná fáze. Krvácení může vznikat kyselou hydrolýzou vázané fáze při nízkých hodnotách pH mobilní fáze nebo rozpouštěním křemičitého substrátu za zásaditějších podmínek. Většina výrobců kolon doporučuje používat kolony na bázi oxidu křemičitého v rozmezí pH 2 až 7,5, nicméně při použití mobilních fází o pH 2-3 může docházet k hydrolýze fáze C18 a v běžně používaném rozmezí pH dochází k pomalému rozpouštění křemičitých substrátů.
V této zprávě zkoumáme rozsah výtoku stacionární fáze u několika komerčně dostupných fází s polární vazbou obsahující dusík. Studie využívá mobilní fázi s nízkým pH, která vyvolává hydrolýzu vázané fáze, spolu s gradientovou elucí, která zajišťuje eluci veškerého uvolněného materiálu fáze. Před analýzou byly všechny kolony použité v této studii důkladně promyty a uloženy v poměru 50:50 methanol: voda po dobu dvou dnů. Tento postup snižuje pravděpodobnost pozorování krvácení z jiných zdrojů než z důvodu nestability stacionární fáze.
Experimentální
Analýzy krvácení byly provedeny na systému Waters® (Milford, MA USA) 2795 HPLC spojeném s hmotnostním spektrometrem Waters Micromass ZQ prostřednictvím rozhraní pro elektrosprej. Rozhraní bylo provozováno v režimu pozitivních iontů a byl získán rozsah m/z od 50 do 1500.
Acetonitril a voda byly LC-MS kvality. Kyselina mravenčí získaná od stejného dodavatele byla v kvalitě HPLC. Před každou analýzou s vypuštěním kolony byl pořízen slepý běh bez použití kolony v řadě, aby se zjistily odezvy způsobené nečistotami systému. Každá kolona byla následně podrobena pěti gradientovým cyklům. Podmínky HPLC jsou uvedeny na obrázku A.
Obrázek A.Akumulované hmotnostní spektrum pro polární stacionární fáze Ascentis™ RP-Amide a Urea (565324-U)
Výsledky a diskuse
Informačně bohaté experimenty LC-MS je obtížné prezentovat v jejich úplnosti. Pro stručnost byla kombinovaná hmotnostní spektra pro každý běh získána kumulací spekter v časovém rozmezí 14-16 minut. Právě v tomto časovém rozmezí je pozorována největší koncentrace hmotnostních odezv způsobených fázovým krvácením. Kromě toho jsou spektrální odezvy v této zprávě uvedeny v rozsahu m/z 200-600. Prezentace dat v tomto rozsahu zabraňuje komplikacím způsobeným hojnými hmotnostními odezvami v nízkých m/z rozmezích, které pocházejí z kontaminace systému. Hmotnostní spektrum získané pomocí stacionární fáze Ascentis RP-Amide je porovnáno s odezvou polární fáze s močovinou na obrázku A.
Spektrum Ascentis RP-Amide vykazuje omezený počet hmotnostních odezv v důsledku krvácení kolony v této oblasti. Tabulka 1 uvádí významné hmotnostní odezvy, které nebyly pozorovány při slepých pokusech pro kolonu Ascentis RP-Amide a několik komerčně dostupných amidových, karbamátových a močovinových polárně zabudovaných fází. Fáze Ascentis RP-Amide vykazuje tři menší hmotnostní odezvy, které lze připsat výtoku ze stacionární fáze (m/z 355, 359 a 377). Analýza z komerčně dostupné fáze s polární vestavbou močoviny vykazuje četné intenzivní hmotnostní odezvy ve zkoumané oblasti, což svědčí o značném krvácení. U karbamátové fáze jsou hmotnostní odezvy podstatně nižší intenzity než u kolony s močovinou; existují však další hmotnostní odezvy, které lze přičíst vyvločkování fáze. To zvyšuje pravděpodobnost interference analytu fázovým výkvětem, což může vést ke zvýšeným obtížím při spektrální interpretaci. Druhá komerčně dostupná amidová fáze vykazuje stejný počet hmotnostních odezv jako kolona Ascentis RP-Amide, avšak dochází k výraznému zvýšení intenzity odezvy, což má za následek vyšší pozadí.
Závěry
V této studii jsme zkoumali charakteristiky vyprchávání LC-MS stacionárních fází obsahujících dusík. Výsledky ukazují, že fáze Ascentis RP-Amide vykazuje ve srovnání s jinými komerčně dostupnými kolonami s polární vestavbou méně a méně intenzivních reakcí na hmotnostní spektrum bleed. Nízký výtok stacionární fáze vede k lepší detekci stopových nečistot, usnadňuje interpretaci hmotnostních spekter a minimalizuje prostoje způsobené kontaminací zdroje.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?