Benzonáza^® Nukleáza Otázky a odpovědi

Na jaký typ nukleových kyselin působí nukleáza Benzonase^®? Mohu ji použít při izolaci RNA?

Benzonáza^® Nuclease je promiskuitní endonukleáza, která napadá a rozkládá všechny formy DNA a RNA (jednovláknové, dvouvláknové, lineární i cirkulární).

Pro jaké účely bych chtěl použít Benzonase^® Nuclease?

Mezi aplikace patří: snížení viskozity pro usnadnění zpracování (např, purifikace rekombinantních proteinů, aplikace citlivé na viskozitu při použití lyzátů savčích buněk atd.); snížení shlukování ve skladovaných vzorcích mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) před zpracováním; příprava inkluzních tělísek umožňující úspěšnou renaturaci proteinů; a odstranění negativně nabitých nukleových kyselin ze vzorků před dvourozměrnou SDS-PAGE.

Jak lze inaktivovat Benzonase^® Nuclease? Jak ji lze odstranit?

Reverzibilní inhibice lze dosáhnout pomocí EDTA, která chelatuje základní ionty kovů. Nevratné inaktivace lze dosáhnout pouze za extrémních podmínek (100 mM NaOH při 70 °C po dobu 30 minut). Benzonázu lze od cílového produktu oddělit pomocí chromatografie. Vzhledem k robustní povaze této endonukleázy však nedoporučujeme Benzonázu používat, pokud je požadován konečný produkt bez nukleázy.

Moje Benzonáza^® Nuclease zůstala na stole. Je stále dobrá?

Provedli jsme rozsáhlé testy stability Benzonase Nuclease a zjistili jsme, že je mimořádně stabilní. I při delší inkubaci při 37 °C si Benzonase^® Nuclease udržovala > 90% aktivitu po dobu několika měsíců.

Chci použít jiný pufr. Jaké podmínky jsou nezbytně nutné pro plnou aktivitu Benzonase^® Nuclease? Co sníží její aktivitu?"

Benzonáza® Nuclease vyžaduje pro svou aktivitu 1-2 mM Mg2+. Benzonázu inhibují (přibližně 50% aktivita) koncentrace monovalentních kationtů >50%, koncentrace fosforečnanů >20 mM a koncentrace síranu amonného >25 mM.

Je Benzonase^® Nuclease kompatibilní s koktejly inhibitorů proteáz?

Ano. Je však třeba dbát zvýšené opatrnosti, protože mnoho koktejlů inhibitorů proteáz obsahuje EDTA. Koncentrace vyšší než 1 mM EDTA bude inhibovat aktivitu benzonázy.

Můj protein je nerozpustný a potřebuji provést purifikaci za denaturačních podmínek. Bude Benzonase^® Nuclease stále fungovat v močovině?

Aktivita enzymu Benzonase^® Nuclease se skutečně zvyšuje v přítomnosti močoviny v koncentracích do 6 M. Při 6 M močoviny se aktivita enzymu nejprve zvyšuje, pak se časem snižuje. Při 7 M močoviny benzonázová nukleáza po 15 minutách denaturuje a aktivita se ztrácí. Před inaktivací však dochází k významné degradaci nukleových kyselin. Vyšší počáteční koncentrace Benzonase Nuclease mohou částečně kompenzovat účinky 7 M močoviny.

Proč máte tolik druhů Benzonase^® Nuclease? Co znamená HC? Jaký vliv má čistota 90 % versus 99 %?"

Aby bylo možné splnit co nejširší škálu požadavků na zpracování a náklady, je Benzonase^® Nuclease k dispozici ve dvou různých stupních čistoty: Stupeň čistoty I (>99% čistota) a stupeň čistoty II (>90% čistota). Obě třídy jsou k dispozici v koncentraci 25 U/μl nebo ve vysoké koncentraci (HC), která je definována jako 250 U/μl. Pro hromadné nákupy kontaktujte zákaznické služby.

Jaký je konečný výsledek úplné degradace nukleové kyseliny nukleázou Benzonase^®?

Nukleáza Benzonase^® kompletně naštěpí nukleové kyseliny na oligonukleotidy zakončené 5'-monofosfátem o délce 2-5 bází.