PCR-Technologien Protokolle Inhaltsverzeichnis
Optimierung der qPCR-Bedingungen
Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.
Die Analyse von Genexpressionsdaten erfordert eine stabile Referenz- oder Ladekontrolle. Diese Referenz besteht in der Regel aus einem oder mehreren Referenzgenen. Geeignete Referenzgene sind Gene, die von Abweichungen zwischen den Proben und experimentellen Behandlungen nicht beeinflusst werden. Sie müssen für jedes experimentelle Modell bestimmt werden. Bei der Durchführung eines Versuchs zur Auswahl stabiler Referenzgene ist es von entscheidender Bedeutung, dass die ausgewählten Gene von verschiedenen biologischen Signalwegen stammen und dass ihre Expression unabhängig voneinander reguliert wird. Idealerweise werden alle Referenzgenkandidaten an einer Auswahl von fünf Test- und fünf Kontrollproben getestet.
Ausrüstung
- Gerät für die quantitative PCR
- Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional)
Reagenzien
- cDNA im Verhältnis 1:100 verdünnt (die stärker verdünnte cDNA reicht in der Regel aus, um hoch exprimierte Referenzgene nachzuweisen, für mittelstark exprimierte Gene wird eine Verdünnung von 1:10 eingesetzt).
- KiCqStart® SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - abhängig vom Instrument, Tabelle P4-6).
- Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden.
- Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Testreferenzgene (Stammlösung bei 10 μM). Hinweis: Eine geeignete Liste von Genen ist in Tabelle P15-37 enthalten. Diese sind als KiCqStart® Primer erhältlich, bei denen es sich, wie dargestellt, um vorgefertigte Assays handelt (die Sequenzen der Primer sind im Lieferumfang des Produkts enthalten).
Materialien
- Sterile Filter-Pipettenspitzen
- Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
- PCR-Röhrchen und -Platten. Eins auswählen, um das gewünschte Format zu erhalten:
• Einzelne dünnwandige 200 μl PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
• Platten
- 96-Well-Platten (Z374903)
- 384-Well-Platten (Z374911)
• Plattendichtungen
- ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)
Anmerkungen zu diesem Protokoll
- cDNA wird mit dem ReadyScript® RT-Kit erzeugt, das eine Kombination aus Zufalls- und Oligo-dT-Priming enthält (siehe Standardprotokoll für reverse Transkription (zweistufig) und Reverse Transkription).
- Wenn Sie eine PCR-Platte verwenden, folgen Sie einem Plattenschema, um sicherzustellen, dass die Reaktionsmischung, die Proben und die Kontrollen in die richtigen Wells gegeben werden.
- Testen Sie eine breite Palette von Genen, die als Referenzgene in Frage kommen. Diese sollen in verschiedenen funktionellen Genpfaden exprimiert werden. Eine Auswahl möglicher KiCqStart® SYBR® Primer für einige Modellorganismen ist in
Tabelle P15-37 aufgeführt. OligoArchitect ist ein geeignetes Designwerkzeug für alternative Primerdesigns (siehe OligoArchitect™ Assay-Design und PCR/qPCR/dPCR Assay-Design).
Methode
1. Berechnen Sie die Anzahl der für jedes Referenzgen erforderlichen Reaktionen. Bereiten Sie eine ausreichende Mischung für zwei Reaktionen pro Probe vor. Wenn beispielsweise 5 Test- und 5 Kontrollproben geprüft werden, ergeben sich zwei Negativkontrollen (NTC) = 22 Reaktionen. Berechnen
Sie einen Zuschlag von 10 %, um Pipettierfehler auszugleichen.
2. Bereiten Sie den qPCR-Mastermix für jedes Referenzgen-Primerpaar gemäß Tabelle P15-38 vor. Geben Sie keine cDNA in den Mastermix. Gut mischen und Blasenbildung vermeiden.
3. 15 μl des Mastermix in die definierten Röhrchen/Wells geben.
4. 5 μl des entsprechenden Templates (Probe oder Wasser für NTC) in die definierten Röhrchen/Vertiefungen geben.
5. Röhrchen verschließen oder Platten versiegeln und beschriften. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt)
6. Die Reaktionen nach dem folgenden dreistufigen Protokoll durchführen (Tabelle P15-39). Die Schritte 1-3 werden in 40 Zyklen wiederholt.
7. Datenanalyse, um die Daten zu analysieren und das stabilste Referenzgen oder die stabilste Genkombination zu bestimmen.
Hinweis: Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).
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