ChIP-qPCR- und Datenanalyse

Einführung in die ChIP-qPCR

Mit der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) kann die DNA-Konzentrationen mehrerer Proben in Echtzeit quantifiziert werden, indem die Intensität von Fluoreszenzsignalen analysiert wird, die proportional zur Menge des Amplikons nach Abschluss des Chromatin-Immunpräzipitations-Assays (ChIP) und der Probenaufreinigung sind. Bei der qPCR werden DNA-Proben mit Primern, Polymerasen, Oligonukleotiden und Nachweisfluorophoren wie TaqMan^® Sonden (fluoreszierende Donor:Quencher-Hybridisierung) oder SYBR^® Green Interkalationsfarbstoff (keine spezifische Sonde erforderlich) inkubiert. Die DNA-Probe wird durch die DNA-Polymerase zyklisch amplifiziert, wobei die Produkte des vorherigen Zyklus zu Templates für den nächsten Zyklus werden und sich die vervielfältigte DNA im Fall optimalster Reaktionen in jedem Zyklus verdoppelt. Stellen Sie für eine erfolgreiche Analyse sicher, dass Ihre Primer die beabsichtigte Sequenz mit einer Effizienz von über 95 % amplifizieren und dass sie keine Dimere bilden, die das spezifische Signal der auf der SYBR^® Green-Technologie basierenden qPCR verschlechtern könnten.

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Zwei häufig verwendete Nachweismethoden für qPCR sind die SYBR ^® Green-Technologie und die TaqMan^® Sondentechnologie. SYBR^® Green ist ein DNA-bindender Farbstoff, der seine Fluoreszenz drastisch erhöht, wenn er an doppelsträngige DNA gebunden ist. Das Fluoreszenzsignal nimmt daher mit der Anzahl der Kopien der doppelsträngigen DNA zu. Der Nachweis kann auch mit TaqMan^® Sonden erfolgen. Bei dieser Methode werden ein Reporter-Fluorophor und ein Quencher-Fluorophor in eine einzige, sequenzspezifische Sonde eingebaut, die Ihr PCR-Amplikon erkennt. Bei der freien Sonde wird das Signal des Reporters durch die Nähe zum Quencher-Fluorophor gelöscht. Nach der Hybridisierung mit dem Amplikon baut die 5'→3'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase die Sonde ab und setzt freie Fluorophore im Verhältnis zur Menge der für die Hybridisierung verfügbaren Template-Moleküle frei. Bei beiden vorgenannten qPCR-Techniken folgt das Fluoreszenzsignal einer linearen Phase, gefolgt von einer Plateauphase, wenn eine Komponente der Reaktion geschwindigkeitsbegrenzend wirkt.

Vergleich der SYBR^® Green und TaqMan^® Nachweismethoden für ChIP-qPCR

	Farbstoff SYBR® Green	TaqMan® Sonde
Nachweis	Weist doppelsträngige DNA nach	Weist Amplikon durch Hybridisierung und Sondenabbau nach
Durchsatz	Einfaches Ziel	Kann multiplexen
Technische Herausforderung	Gering; einfaches Versuchsprotokoll	Mäßig hoch; erfordert gut konzipierte Primer und Sonden und Optimierung jedes Primer-/Sondensatzes
Kosten	+	++
Spezifität	+ Kann unspezifische Signale wie Primer-Dimere und andere Nukleinsäure-Moleküle erkennen, die nicht von Interesse sind	++ Geringe unspezifische Bindung

qPCR-Tipp

Bevor Sie mit der qPCR beginnen, müssen Sie die Vernetzungen sowohl in der Eingabe- als auch in der Testprobe mit Proteinase K und Hitze umkehren. In manchen Fällen muss die DNA durch eine Lösungsmittelextraktion (Phenol:Chloroform) aufgereinigt werden.

Die Fluoreszenzsignale zeigen die Zyklusschwelle (Ct)* für jede Probe an. Der Ct-Wert ist der Punkt der linearen Phase, an dem das Fluoreszenzsignal den Hintergrund übersteigt. Der Ct-Wert hängt von der Menge der DNA in der Probe ab. Wenn Ihre Probe relativ große Mengen an Ziel-DNA enthält, sind weniger Zyklen erforderlich, um den Hintergrund zu überschreiten, und der Ct-Wert wird niedrig sein. Ist die Menge Ihrer Ziel-DNA hingegen gering, werden mehr Zyklen durchgeführt, bevor Ct erreicht wird. Die ChIP-Analyse mittels qPCR funktioniert am besten, wenn mit verdünnten DNA-Proben begonnen wird (im Gegensatz zu hoch konzentrierten Templates, welche die Taq-Polymerase hemmen können, wenn sie in hohen Konzentrationen vorliegen). Befolgen Sie daher die verfügbaren Protokolle, in denen typische Volumen von ChIP-DNA für die qPCR-Analyse beschrieben werden, wie z. B. 2 µl aus 50 µl ChIP-Probe, um die Einführung von PCR-Inhibitoren in die Reaktion zu vermeiden.

*HINWEIS: In den aktuellen Leitlinien der "Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" (MIQE) wird empfohlen, bei der Meldung von qPCR-Daten den "Quantifizierungszyklus" (Cq) anstelle der "Zyklusschwelle" (Ct) zu verwenden. Weitere Informationen zu diesem Thema sowie Empfehlungen zu geeigneten durchzuführenden Kontrollen, Standards für die Datenanalyse und Fehlerberichte finden Sie unter http://www.rdml.org/miqe.php.

Bestimmen der Effizienz von qPCR-Reaktionen

Um aussagekräftige Informationen aus der qPCR-Analyse zu gewinnen, ist es wichtig, bestimmte Parameter zu messen, um sicherzustellen, dass der Assay ordnungsgemäß funktioniert. Testen Sie zunächst die Effizienz (E) der qPCR-Reaktion. Die Effizienz der qPCR-Reaktion wird in der Regel als Prozentwert ausgedrückt und gibt den Prozentsatz des in jedem Zyklus amplifizierten Templates an. Die beste Möglichkeit, die Reaktionseffizienz zu testen, besteht in der Erstellung einer Standardkurve, indem fünf serielle Verdünnungen einer Probe mit bekannter Konzentration durchgeführt und die entsprechenden Ct-Werte geplottet werden, um eine Standardkurve zu erstellen.

Für den DNA-Standard, der für die qPCR-Optimierungsexperimente verwendet wird, können fragmentierte, aufgereinigte genomische DNA oder, was noch bequemer ist, aus Ihrem Chromatin isolierte DNA als Eingabeprobe verwendet werden. Diese Eingangsprobe kann einen kleinen Prozentsatz (2 bis 5 %) der gesamten Chromatinprobe ausmachen. Die Chromatinprobe soll mit Proteinase K verdaut, durch Vernetzung umgekehrt und aufgereinigt werden, um ein geeignetes Kontrollmaterial für die Entwicklung des Assays oder die Berechnung der Effizienz zu erhalten. In der qPCR-Instrumentensoftware wird die Effizienz oft automatisch berechnet und berichtet, wenn "Standard" als Probentyp ausgewählt wird.

Die Effizienz der Reaktion kann mit folgender Formel berechnet werden:

Effizienz (E) =10^{1/Steigung der Standardkurve}

% Effizienz = (E-1) x 100

Bei einer optimierten Reaktion soll die Effizienz zwischen 95 und 105 % liegen. Wenn die Effizienz nicht innerhalb dieses Bereichs liegt, müssen ggf. mögliche Fehlerquellen im Experiment untersucht werden:

1. Führen Sie von jeder Verdünnung mindestens drei Wiederholungen durch und passen Sie die Verdünnung gegebenenfalls an
2. Verwenden optimierter Puffer
   • a. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen kommerziellen Mastermix, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
   • b. Führen Sie eine Probe durch, die keine DNA enthält, um die Puffer auf Verunreinigungen zu testen
3. Verwenden Sie gut konzipierte Primer - im Idealfall sollen die Ct-Werte zwischen 18 und 30 liegen.
4. Ist die Effizienz immer noch suboptimal, ist es empfehlenswert, die folgenden möglichen Ursachen für die Ineffizienz prüfen:
   • a. Das Amplikon ist zu groß (zwischen 65 und 150 Basen halten)
   • b. Schlechte Primer-Integrität (frische Primer verwenden)
   • c. Zu hohe Primerkonzentration (Primerverdünnung ändern, um Dimere zu vermeiden)
   • d. Kontamination durch Phenol, Salze oder Ethanol in der Template-DNA
   • e. Ungeeignete Grundlinien- oder Schwellenwerteinstellungen des Geräts
   • f. Kontamination in der Kontrolle ohne Template (Verwendung von speziellen Pipetten, UV-bestrahlten Geräten, frischem Milli-Q^® Wasser usw. und Einrichtung in separatem Raum)

ChIP-qPCR-Datenanalyse

Es gibt zwei Ansätze zur Analyse von qPCR-Daten: absolute Quantifizierung und relative Quantifizierung.

Absolute Quantifizierung

Die absolute Quantifizierung ermöglicht die Bestimmung der DNA-Menge in einer bestimmten Probenmenge ohne Durchführung einer vergleichenden Analyse mit anderen Proben. Für diese Analyse wird folgende Vorgehensweise empfohlen:

1. Herstellung serieller Verdünnungen einer Probe mit bekannter Konzentration (quantifizierte, aufgereinigte Eingabe-DNA)
2. Einbindung von mindestens drei Replikaten für jede Verdünnung
3. Durchlaufen dieser Standards parallel zu den/der Testprobe(n)
4. Erstellen einer Standardkurve aus den logarithmischen Mengen der Probe und den Ct-Werten aus der qPCR-Analyse
5. Durchführen einer Regressionsanalyse, um die Gleichung der Standardkurve zu bestimmen, und Verwenden dieser Gleichung zur Berechnung der DNA-Menge in unbekannter/n Probe(n).

Die Menge der Ziel-DNA in der Testprobe soll innerhalb des linearen dynamischen Bereichs des qPCR-Assays liegen. Ist dies nicht der Fall, passen Sie die Verdünnungen der Standardprobe an und wiederholen Sie den Versuch.

Der aus der extrapolierten Ct-Messung abgeleitete angepasste Wert kann als "Nanogramm DNA-Rückgewinnung", "Prozent der Eingabe", "Kopienzahl", "durchschn. Menge" sowie in anderen Varianten, welche die Anzahl der Moleküle beschreiben, angegeben werden. Am häufigsten wird "Prozent der Eingabe" verwendet, wenn Eingabe-DNA als Standard in der relativen Standardkurvenmethode verwendet wird.

Relative Quantifizierung

Bei der relativen Quantifizierungsanalyse wird die Testprobe als relative Änderung im Verhältnis zu einer Kontrollprobe (die mit normalem aufgereinigtem IgG oder Probe-IP immunpräzipitiert wurde) ausgedrückt. Die Testprobe kann auch als prozentualer Anteil eines Referenzgens ausgedrückt werden, von dem bekannt ist, dass es unter den Versuchsbedingungen ein konstantes Expressionsniveau beibehält, ähnlich wie bei der Verwendung von "Housekeeping"-Proteinen in Western-Blot-Analysen oder von Haushaltsgen-cDNA für qRT-PCR-Expressionsanalysen. DNA-Loci, von denen bekannt ist, dass sie nicht vom immunpräzipitierten Protein besetzt sind (negativer Locus), können auf diese Weise als Referenzgen im Vergleich zu bekannten, besetzten positiven Kontroll-DNA-Loci verwendet werden.

1. Berechnen des Eingabeprozentsatzes für jede ChIP:
   %Eingabe = 2^{(-ΔCt [normalisierte ChIP])}
2. Normalisieren Sie die ΔCt-Werte des positiven Locus auf den negativen Locus (ΔΔCt), indem Sie den für den positiven Locus erhaltenen ΔCt-Wert vom ΔCt-Wert des negativen Locus abziehen:
   (^{ΔΔCt = ΔCt}positiv – ^ΔCtnegativ)
3. Berechnen Sie die Anreicherung der relativen Änderung der positiven Locus-Sequenz in der ChIP-DNA gegenüber dem negativen Locus:
   Anreicherung der relativen Änderung = 2^ΔΔCt