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In Situ Cell Death Detection-Kit, AP

sufficient for ≤50 tests, kit of 1 (3 components), suitable for detection

• Synonym(e): Zelltod-Kit
• UNSPSC-Code: 12352200

Eigenschaften

• Verwendung: sufficient for ≤50 tests
• Qualitätsniveau: 100
• Verpackung: kit of 1 (3 components)
• Hersteller/Markenname: Roche
• Methode(n): immunohistochemistry: suitable
• Anwendung(en): detection
• Lagertemp.: −20°C

Beschreibung

Allgemeine Beschreibung

Kit zur Erkennung und Quantifizierung des apoptotischen Zelltods auf Einzelzellebene durch Lichtmikroskopie in der Immunhistozytochemie.

Inhalt:

• Enzymlösung (TdT)
• Markierungslösung (Fluorescein-dUTP)
• Converter-AP (Anti-Fluorescein-Antikörper-AP), gebrauchsfertig

Spezifität

Mit der TUNEL-Reaktion werden vor allem DNA-Strangbrüche markiert, die während der Apoptose erzeugt werden. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose sowie primären DNA-Strangbrüchen, die durch Zytostatika oder Bestrahlung induziert wurden.

Anwendung

Das In Situ Cell Death Detection-Kit (AP) bietet ein präzises, schnelles und einfaches nicht-radioaktives Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des Zelltods durch Apoptose auf Einzelzellebene in Zellen und Geweben mittels Lichtmikroskopie. Es ist nicht für diagnostische Verfahren vorgesehen. Aus diesem Grund kann das In Situ Cell Death Detection-Kit für viele verschiedene Assay-Systeme eingesetzt werden. Zum Beispiel:

• Nachweis von einzelnen apoptotischen Zellen in gefrorenen und Formalin-fixierten Gewebeschnitten in der Grundlagenforschung†[1][2]
• Bestimmung der Sensitivität maligner Zellen gegenüber medikamenteninduzierter Apoptose in der Krebsforschung[3]
• Typisierung von Zellen, die den Zelltod durchlaufen, in heterogenen Populationen durch Doppelfärbung

Leistungsmerkmale und Vorteile

• Empfindlich: Die maximale Markierungsintensität (Zellfärbung) von apoptotischen Zellen ist höher als bei der Nick-Translationsmethode.
• Schnell: Durch die Verwendung von Fluorescein-dUTP können die Proben direkt nach der TUNEL-Reaktion, aber vor der Hinzufügung des zweiten Detektionssystems analysiert werden.
• Praktisch: Die direkte Markierung mit Fluorescein-dUTP ermöglicht die Verifizierung der Effizienz der TUNEL-Reaktion während des Assay-Verfahrens.
• Genau: Apoptose wird auf molekularer Ebene (DNA-Strangbrüche) identifiziert und Zellen werden in sehr frühen Apoptosestadien erkannt.
• Flexibel: Kein Substrat enthalten; bietet die Möglichkeit einer Auswahl des bevorzugten Färbeverfahrens.

Verpackung

1 Kit mit 3 Komponenten.

Spezifikationen

Häufig verwendete Methoden zur Bestimmung der Apoptose umfassen die Analyse der genomischen DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese sowie DNA-Fragmentierungsassays auf Grundlage von ³H-Thymidin bzw. alternativ 5-Brom-2′-desoxyuridin. Bei diesen Methoden wird in einer gegebenen Zellpopulation fragmentierte DNA mit geringem Molekulargewicht von unfragmentierter DNA mit hohem Molekulargewicht getrennt. Daher geben diese Methoden keinen Aufschluss über den Zustand einzelner Zellen in einer gegebenen Zellpopulation und insbesondere in Gewebeschnitten. Alternativ können einzelne apoptotische Zellen aufgrund des charakteristischen Erscheinungsbildes der Kondensation und Fragmentierung von nukleärem Chromatin mikroskopisch erkannt werden, doch diese Methode ist subjektiv und auf ein relativ enges Zeitfenster beschränkt, in dem die morphologischen Veränderungen maximal ausgeprägt sind.
Das typische Kennzeichen von Apoptose ist der DNA-Abbau, der in den Frühphasen selektiv an den internukleosomalen DNA-Linker-Regionen erfolgt. Aus der Aufspaltung der DNA können doppel- und einsträngige DNA-Bruchstücke (Nicks) entstehen. Beide Arten von Brüchen können durch Markierung der freien 3′-OH-Termini mit modifizierten Nukleotiden (z. B. Biotin-dUTP, DIG-dUTP, Fluorescein-dUTP) in einer enzymatischen Reaktion detektiert werden. Die terminale Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) ist ein Enzym, das die Template-unabhängige Polymerisierung von Desoxyribonukleotiden an die 3′-Enden von doppel- oder einsträngiger DNA katalysiert. Diese Methode wird auch TUNEL genannt (TdT-vermittelte dUTP-X-Nick-Enden-Markierung). Alternativ können die freien 3′-OH-Gruppen durch einen Template-abhängigen Mechanismus namens „Nick-Translation“ mithilfe von DNA-Polymerasen markiert werden. Die TUNEL-Methode gilt jedoch als empfindlicher und schneller.

Probenmaterial: Zytospin und Präparate von Zellabstrichen, auf Objektträgern gewachsene adhärente Zellen sowie eingefrorene und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte.

Prinzip

Das In Situ Cell Death Detection-Kit (AP) basiert auf der Erkennung von Einzel- und Doppelstrang-DNA-Brüchen, die im Frühstadium der Apoptose entstehen.
Apoptotische Zellen werden fixiert und permeabilisiert. Anschließend werden die Zellen mithilfe des TdT und Fluorescein-dUTP enthaltenden TUNEL-Reaktionsgemischs inkubiert. Während dieser Inkubationszeit katalysiert die TdT die Addition von Fluorescein-dUTP an freie 3′-OH-Gruppen in einzel- und doppelsträngiger DNA. Nach dem Waschen wird der an den beschädigten Stellen der DNA befindliche Marker durch einen mit dem Reporterenzym alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Fluorescein-Antikörper markiert. Nach dem Waschen, bei dem das ungebundene Enzymkonjugat entfernt wird, wird die im Immunkomplex zurückgehaltene AP durch eine Substratreaktion visualisiert.

Angaben zur Herstellung

Arbeitslösung: Das Gesamtvolumen (50 μl) der Enzymlösung den verbleibenden 450 μl der Markierungslösung hinzufügen; dies ergibt 500 μl TUNEL-Reaktionsgemisch.
Gut mischen, um die Komponenten zu äquilibrieren.
Lagerbedingungen (Arbeitslösung): TUNEL-Reaktionsgemisch
Das TUNEL-Reaktionsgemisch sollte unmittelbar vor Gebrauch zubereitet und nicht gelagert werden. Das TUNEL-Reaktionsgemisch bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren.

Converter AP
Die Converter-AP-Lösung sollte nach dem Auftauen bei 2 bis 8 °C gelagert werden (maximale Stabilität
6 Monate).
Hinweis: Nicht einfrieren.

Sonstige Hinweise

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht für den Einsatz in diagnostischen Verfahren geeignet.

Nur Kit-Komponenten

• Enzyme Solution (TdT)
• Label Solution (fluorescein-dUTP)
• Converter AP (anti-fluorescein antibody-AP) ready-to-use

Sicherheitshinweise

• Piktogramme: GHS07,GHS08,GHS09
• Signalwort: Danger
• H-Sätze: H317,H350i,H411
• P-Sätze: P201 - P261 - P273 - P280 - P308 + P313 - P391
• Gefahreneinstufungen: Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B Inhalation - Skin Sens. 1
• Lagerklassenschlüssel: 6.1D - Non-combustible acute toxic Cat.3 / toxic hazardous materials or hazardous materials causing chronic effects
• WGK: WGK 3
• Flammpunkt (°F): does not flash
• Flammpunkt (°C): does not flash