RT-qPCR – PCR por transcrição reversa quantitativo

A RT-qPCR, ou PCR de transcrição reversa quantitativa, combina os efeitos da transcrição reversa e da PCR quantitativa ou PCR em tempo real para amplificar e detectar alvos específicos. A RT-qPCR tem várias aplicações, incluindo a quantificação dos níveis de expressão gênica, a validação da interferência de RNA (RNAi) e a detecção de agentes patogênicos, como vírus. As abordagens comuns para gerar um sinal fluorescente usado para medir a quantidade de DNA nessa técnica são usar sondas de hidrólise, como as sondas TaqMan^®, ou um corante de ligação de DNA de fita dupla, como o corante SYBR^® Green.

O que é RT-qPCR?

A PCR de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) envolve a detecção e a quantificação do RNA. O processo é realizado pela transcrição reversa do RNA total ou mRNA para DNA complementar (cDNA) pela enzima transcriptase reversa, seguida pela amplificação e detecção de alvos específicos desse cDNA usando uma técnica chamada PCR quantitativa (qPCR) ou PCR em tempo real. A cada ciclo durante essa PCR, a quantidade de DNA é medida em tempo real usando uma variedade de produtos químicos fluorescentes. As abordagens mais comuns para gerar um sinal fluorescente são usar sondas de hidrólise, como as sondas TaqMan^®, ou um corante de ligação de DNA de fita dupla, como o corante SYBR^® Green.

A seleção da química fluorescente depende de fatores como a aplicação, o custo e o fato de o ensaio ser um ensaio singleplex ou multiplex. Os corantes de ligação ao DNA são preferidos para ensaios singleplex de baixo rendimento, pois são mais fáceis de projetar, têm menor tempo de preparação e são mais econômicos. As sondas fluorescentes são mais comumente empregadas em ensaios multiplex de alto rendimento que exigem maior especificidade.

Para obter mais informações sobre qPCR, consulte nosso Guia técnico de PCR quantitativo

Aplicações de RT-qPCR

A RT-qPCR tem várias aplicações. A técnica RT-qPCR é usada para:

• quantificar os níveis de expressão gênica
• validar o RNAi para estudar a perda de função de genes seletivos
• detectar agentes patogênicos, como vírus, para o diagnóstico de doenças infecciosas
• detectar organismos geneticamente modificados (GMOs)

RT-qPCR em uma etapa vs. RT-qPCR em duas etapas

A RT-qPCR é realizada em um ensaio de uma etapa ou de duas etapas. É importante considerar vários fatores, como custo, aplicação e tipo de ensaio, ao escolher o tipo certo de método RT-qPCR.

Figura 1. Diagrama comparando o fluxo de trabalho de RT-qPCR em uma etapa com o fluxo de trabalho de RT-qPCR em duas etapas.

RT-qPCR em uma etapa

Na RT-qPCR em uma etapa, a transcrição reversa ou a síntese de cDNA e a qPCR são realizadas em um único tubo, usando primers específicos de sequência para a amplificação de um alvo específico. As transcriptases reversas geneticamente modificadas são comumente empregadas em ensaios de uma etapa, pois toleram temperaturas mais altas necessárias para o hibridização de primers específicos de sequência. Um ensaio de uma etapa é preferível quando a quantificação repetida do mesmo gene é realizada, especialmente em aplicações de diagnóstico e de alto rendimento. Outra consideração ao escolher ensaios em uma etapa é a qualidade e a escassez do RNA. Como o cDNA sintetizado durante a reação não pode ser salvo separadamente como uma alíquota, podem ser necessárias mais amostras do RNA original para repetir o ensaio.

RT-qPCR em duas etapas

Na RT-qPCR em duas etapas, as reações de transcrição reversa e qPCR são realizadas em tubos separados com tampões e reagentes separados. Hexâmeros aleatórios, primers oligo-dT e/ou primers específicos de genes podem ser usados em ensaios de duas etapas. Ter tampões e reagentes separados permite mais flexibilidade na escolha das enzimas de transcriptase reversa e dos reagentes de PCR, com mais opções para otimizar e melhorar a eficiência da amplificação de modelos difíceis. O cDNA mais estável que é sintetizado na primeira etapa pode ser concentrado e/ou purificado para ser armazenado para uso futuro ou pode ser usado para a quantificação de vários genes da mesma amostra.

Tabela 1. Principais recursos e primers usados em ensaios RT-qPCR de uma e duas etapas.

Tipo de ensaio	Primers usados	Principais características
RT-qPCR de uma etapa	Primers específicos de sequência	Redução da variação experimental Fácil manuseio com baixo risco de contaminação Protocolo mais rápido com menos etapas Automação fácil Especificidade aprimorada Ideal para aplicações de alto rendimento
RT-qPCR de duas etapas	Primers oligonucleotídeo (dT), hexâmeros aleatórios e/ou primers específicos de sequência	Flexibilidade para otimizar reações de RT e PCR separadamente Permite várias PCRs a partir de uma única amostra de RNA/RT sem multiplexação Mais opções de primers de RT O cDNA estável pode ser armazenado para uso futuro

Saiba mais sobre a otimização de ensaios de PCR em nossa página Otimização e validação de ensaios

Produtos RT-qPCR de uma etapa para aplicações de alto rendimento

Nossos produtos RT-qPCR de uma etapa combinam o efeito da transcriptase reversa com o anticorpo Taq direcionado para início a quente em convenientes misturas de reação de PCR ReadyMixTM para aplicações baseadas em sonda ou SYBR^® Green. Independentemente das estruturas secundárias difíceis ou da química de detecção, nossas misturas de reação de PCR ReadyMixTM são especialmente formuladas para ajudar a obter resultados superiores em menos etapas.

Nossos produtos se encaixam facilmente em seu fluxo de trabalho de PCR e, com uma variedade de produtos confiáveis para experimentos de RT-qPCR em uma etapa, você não fará uma escolha errada. Descubra os produtos KiCqStart^® e encontre uma mistura-mestre ReadyMix™ otimizada para seu instrumento ou explore nossas opções JumpStart™ para kits otimizados para suas necessidades experimentais. Para a quantificação de RNA de alta produtividade, ciclo rápido e em uma única etapa usando sondas fluorogênicas específicas de sequência, escolha o kit universal KAPA PROBE FAST. Escolha com confiança qualquer um de nossos produtos RT-qPCR sem comprometer a qualidade.

One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ KiCqStart^® – Compatível com todos os principais instrumentos de qPCR

Nossos reagentes KiCqStart^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ apresentam um rigoroso mecanismo de hot-start para maior especificidade e são formulados para serem altamente tolerantes aos inibidores de PCR nas amostras. Essas misturas-mestre altamente sensíveis e prontas para uso foram projetadas para serem convenientes e contêm todos os componentes básicos necessários para qPCR ou RT-qPCR. Basta adicionar seus primers, sonda e água para completar o coquetel de ensaio. Esse produto é ideal para qPCs rápidos ou convencionais

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
KCQS07	Mistura para RT-qPCR KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™	Para instrumentos Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® e Roche®
KCQS08	Mistura para RT-qPCR KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, baixa concentração de ROX™	Para instrumentos Applied Biosystems® (ABI) e Stratagene®
KCQS09	Mistura para RT-qPCR KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, com RO	Para instrumentos Applied Biosystems® (ABI)

Saiba mais sobre a compatibilidade de instrumentos com esses produtos em nossa Tabela completa de compatibilidade de instrumentos ou descubra nossas Sondas qPCR personalizadas.

JumpStart™ Taq ReadyMix™ – Otimizável para todos os principais instrumentos de qPCR

Nossos produtos JumpStart™ Taq ReadyMix™ para RT-qPCR combinam as vantagens da Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (M-MLV RT) e nossa Taq polimerase inativada por anticorpos JumpStart™. O RT M-MLV robusto tem a capacidade de transcrever através de estruturas secundárias difíceis, mesmo em temperaturas elevadas, enquanto nossa polimerase Taq JumpStart™ oferece maior especificidade e sensibilidade do que a polimerase Taq padrão. Esses produtos são compatíveis com instrumentos baseados em tubos e placas, bem como com instrumentos baseados em capilares.

Economize 20% no RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200) usando o código SGX na finalização da compra. Válido até 31 de janeiro de 2021.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
QR0100	RT-qPCR SYBR® Green	Alta especificidade, baixo risco de contaminação, fácil reprodutibilidade
QR0200	RT-qPCR ReadyMix™ para aplicações baseadas em sonda	Alta especificidade, baixo risco de contaminação, fácil reprodutibilidade

KAPA PROBE FAST – Compatível com todas as tecnologias baseadas em sondas fluorogênicas

O KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix Universal Kit é uma solução sensível e conveniente para PCR em tempo real usando RNA como modelo. O kit foi projetado para quantificação de RNA de alta produtividade, ciclo rápido e em uma única etapa, usando sondas fluorogênicas específicas da sequência. É compatível com todas as tecnologias baseadas em sondas fluorogênicas, inclusive sondas de hibridização (por exemplo, sondas de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET)), sondas de hidrólise (por exemplo, sondas TaqMan^®) e sondas de deslocamento (por exemplo, sinalizadores moleculares).

Esse kit é um coquetel pronto para uso que contém todos os componentes, exceto primers, sonda(s) e modelo para PCR em tempo real de ciclo rápido e baseado em sonda. O kit contém o KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix, os corantes de referência ROX High e ROX Low, o KAPA RT Mix e o dUTP.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
KK4752	Kit universal KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X)	Quantificação de RNA de alto rendimento, ciclo rápido e em uma única etapa usando sondas fluorogênicas específicas da sequência

ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit – Compatível com todos os principais instrumentos de qPCR

A transcriptase reversa ABScript II do kit proporciona uma transcrição reversa confiável do RNA. Após a transcrição reversa, a versão hot-start da Taq polimerase é ativada a 95 °C e a transcriptase reversa ABScript II é inativada simultaneamente. Na reação de PCR sequencial, a atividade de exonuclease 5′-3′ da Taq polimerase cliva a sonda hibridizada, separando o repórter do redutor e liberando um sinal fluorescente.

O ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit é um kit pronto para uso para transcrição reversa e subsequente qPCR com base em sonda em um único tubo. O formato flexível desse kit inclui duas concentrações separadas de 50X do corante ROX (referência passiva), a serem adicionadas conforme exigido por instrumentos específicos de qPCR.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
RK20407	Kit de sonda ABScript II One Step RT-qPCR	Analisa amostras de RNA de baixa entrada, com baixo risco de contaminação

Somente para fins de pesquisa. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Produtos RT-qPCR de duas etapas para maior flexibilidade

Oferecemos todos os reagentes necessários para realizar a transcrição reversa seguida da análise de PCR do cDNA sintetizado em tubos separados para maior flexibilidade em seus experimentos. Incorpore com confiança nossos produtos RT-qPCR de duas etapas em seu fluxo de trabalho de PCR sem comprometer a flexibilidade. Com várias opções disponíveis para nossos confiáveis produtos de PCR, você não fará uma escolha errada.

Kits e misturas para síntese de cDNA

Para atender às suas necessidades de transcrição reversa, escolha entre vários tipos de enzimas e diversas opções de embalagem. Todos esses produtos incluem os reagentes necessários para a síntese da primeira fita e estão disponíveis como kits com reagentes separados para otimização ou como misturas completas para a síntese rápida e conveniente da primeira fita.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
STR1	Kit aprimorado de síntese de primeira fita de aves	EAMV-RT altamente purificado — transcreve estruturas secundárias difíceis em alta temperatura Detecta mRNA de baixa abundância
11483188001	Kit de síntese de cDNA First Strand para RT-PCR	Inclui AMV RT para maior termoestabilidade em comparação com o M-MuLV RT Inclui inibidor de RNase e mistura de dNTP para PCR
RDRT	Mistura para síntese de cDNA ReadyScript™	Solução sensível e fácil de usar para RT-PCR em duas etapas A enzima ReadyScript™ é uma RNase H (+) RT de M-MuLV modificada
11117831001	Kit de síntese de cDNA	Procedimento otimizado de um tubo para a síntese de cDNA de fita dupla de até 3 kb a partir de RNA total ou mRNA
THIFICDNARO	Kit de síntese de cDNA de alta fidelidade Transcriptor	Projetado para fazer a transcrição reversa do RNA com maior fidelidade em comparação com outras transcriptases reversas Otimizado para RT-PCR em duas etapas
5893151001	Transcriptor Universal cDNA Master	Solução rápida e conveniente para síntese de cDNA e análise de PCR em tempo real Seja qual for o instrumento de PCR que esteja usando, essa mistura-mestre, fornecida em dois frascos, realiza todo o potencial de seus ensaios de qRT-PCR

Enzimas RT — Transcriptases reversas

Escolha entre nossa coleção de enzimas RT e encontre uma que se adapte à complexidade de sua transcrição de RNA. Nossos produtos incluem as transcriptases reversas padrão do vírus da mieloblastose aviária (AMV) e do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MLV), bem como versões aprimoradas dessas transcriptases para maior sensibilidade.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
A4464	Transcriptase reversa aviária aprimorada	Maior sensibilidade para mRNA de baixa abundância Melhor enzima para transcrever através de uma estrutura secundária difícil
ERT-RO	Transcriptase reversa Expand™	Transcreve fragmentos de cDNA de até 13,5 kb Pode usar cDNA ou DNA de fita simples
M1302	Transcriptase reversa M-MLV	Usa RNA de filamento único, DNA ou híbrido RNA-DNA Gerar cDNA de primeira fita de até 7 kb
10109118001	Transcriptase reversa AMV	Inclui tampão de síntese de cDNA de primeira fita 5X
11062603001	Transcriptase reversa M-MuLV	Não possui atividade de endonuclease e tem atividade de RNase H muito menor do que a do AMV RT
TRANSRTRO	Transcriptor Transcriptase reversa	Obtenha alta sensibilidade em RT-PCR de duas etapas. A Transcriptor Reverse Transcriptase é usada em termocicladores convencionais e instrumentos de PCR em tempo real (por exemplo, os instrumentos LightCycler®). Transcrição reversa de modelos difíceis. A enzima funciona bem em temperaturas elevadas, superando assim a estrutura secundária do RNA (por exemplo, modelos de RNA ricos em GC) e facilitando as condições ideais de reação.

Saiba mais sobre a resolução de problemas de RT-qPCR na página Resolução de problemas de RT-PCR / RT-qPCR.

Kits de qPCR

Esses produtos ReadyMix^TM contêm todos os componentes necessários para qPCR. Basta adicionar a química de detecção fluorescente, os primers e o modelo.

qPCR baseado em sonda

A qPCR baseada em sonda se baseia na detecção específica da sequência de um produto de PCR desejado. Ao contrários dos métodos de qPCR baseados em SYBR^® Green, que detectam todo o DNA de fita dupla, a qPCR baseada em sonda utiliza uma sonda específica do alvo marcada com fluorescência, o que resulta em maior especificidade e sensibilidade. Além disso, uma variedade de corantes fluorescentes está disponível para que vários primers possam ser usados para amplificar simultaneamente muitas sequências.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
D6442	JumpStart™ Taq ReadyMix™ para PCR quantitativo de alto rendimento	Mistura 2x pronta para uso para qPCR com ROX Ideal para métodos de PCR quantitativos e de alto rendimento usando detecção de sonda fluorescente O JumpStart™ Taq evita a amplificação não específica e aumenta o rendimento do alvo
D7440	JumpStart™ Taq ReadyMix™ para PCR quantitativo	Mistura 2x pronta para uso para realizar ensaios de PCR quantitativos que dependem de uma sonda fluorescente
L6669	LuminoCt® qPCR ReadyMix™	Ideal para protocolos qPCR de 2 etapas, rápidos e de alto rendimento, com resultados de ensaios em apenas 25 minutos Para PCR quantitativa rápida baseada em sonda
FSTMPMMRO	FastStart TaqMan® Probe Master	Use com qualquer instrumento de qPCR em tempo real que não sejam instrumentos LightCycler® Escolha entre duas formulações - uma que contém o corante de referência ROX e outra sem ROX Contém dUTP para evitar contaminação por transferência
FSUPMMRO	FastStart Universal Probe Master (Rox)	Obtenha resultados sensíveis e específicos em ensaios com as sondas da biblioteca de sondas universais ou qualquer outra sonda de hidrólise Amplifique fragmentos com até 500 pb de comprimento, inclusive aqueles com alto teor de GC ou AT Contém dUTP para evitar contaminação por transferência
PFUKB	Universal de mistura-mestre para qPCR KAPA PROBE FAST	Compatível com todas as tecnologias baseadas em sondas fluorogênicas, incluindo sondas de hibridização (por exemplo, FRET), sondas de hidrólise (por exemplo, sondas TaqMan®) e sondas de deslocamento (por exemplo, beacons moleculares).

QPCR baseado em SYBR^® Green

O SYBR^® Green I, um corante fluorescente de ligação ao DNA comumente usado, liga-se a todos os DNAs de fita dupla. A detecção é monitorada pela medição do aumento da fluorescência durante todo o ciclo. O SYBR^® Green I tem máximos de excitação e emissão de 494 nm e 521 nm, respectivamente. A especificidade de nossa detecção de qPCR baseada em SYBR^® Green é bastante aprimorada pela incorporação de uma Taq polimerase mediada por hot start, como a JumpStart™ Taq.

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
KCQS02	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ com ROX™	Para instrumentos Applied Biosystems® (ABI)
KCQS01	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox™	Para instrumentos Applied Biosystems® (ABI) e Stratagene®
KCQS00	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	Para sistemas Bio-Rad®, Cepheid®, Eppendorf®, Illumina®, Corbett® e Roche®
KCQS03	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ iQ™	Com fluoresceína para sistemas Bio-Rad®
S4438	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Para PCR quantitativo, com MgCI2 no tampão
S5193	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™	Para PCR quantitativo, sem MgCI2 no tampão
S9194	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ para qPCR de alto rendimento	Reagente SYBR® Green qPCR, corante de referência passivo incluído
S1816	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ para PCR quantitativo	Formulação capilar Reagente SYBR® Green qPCR para sistemas capilares Roche LightCycler®
SFUKB	Universal de mistura-mestre para qPCR KAPA SYBR ® FAST	Detecte baixo teor de cópias e alvos difíceis consistentemente Complete corridas de PCR em tempo real em apenas 40 minutos
FSUSGMMRO	FastStart Universal SYBR® Green Master (Rox)	Para amplificação e detecção de qualquer alvo de DNA ou cDNA, inclusive aqueles ricos em GC ou AT Contém dUTP para evitar contaminação por transferência
L6544	LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	Para PCR quantitativo SYBR® Green rápido com resultados de ensaio em apenas 25 minutos Com um frasco separado de ROX Praticamente elimina a necessidade de otimizar os parâmetros do ensaio

Saiba mais sobre a qPCR baseada em SYBR^® Green neste curto vídeo.

RT-qPCR baseado em microRNA

Encontre os produtos de transcrição reversa de microRNA de que você precisa com nossa linha de produtos MystiCq^®.

MystiCq^® MicroRNA RT-qPCR SystemR

Os reagentes de microRNA MystiCq^® fornecem um fluxo de trabalho completo de RT-qPCR SYBR® Green para quantificar a expressão em apenas três etapas:

1. Isolamento
2. Síntese de cDNA
3. Quantificação por amplificação

Saiba mais sobre o fluxo de trabalho do MystiCq^® em nossa página do produto MystiCq^®. Esses produtos apresentam:

• Mais de 1.400 pares de primers pré-projetados e testados em laboratório úmido, projetados para atingir apenas microRNAs maduros
• Conversão de todos os microRNAs, permitindo leituras quase ilimitadas de uma única amostra
• Seleção de três produtos diferentes para isolamento de microRNA

 

Modelos de ensaios qPCR e reagentes para pesquisa de SARS-CoV-2

Temos o compromisso de fornecer aos pesquisadores recursos e ferramentas confiáveis para apoiar a luta contra a COVID-19 (SARS-CoV-2). Em resposta à necessidade da comunidade de reagentes e protocolos específicos para o SARS-CoV-2, nossos cientistas avaliaram os kits One-Step RT-qPCR baseados em RNA para detecção do alvo SARS-CoV-2. Somente para fins de pesquisa. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Design e métodos experimentais

Esse experimento foi conduzido para determinar se nossos kits One-Step RT-qPCR podem detectar o SARS-CoV-2. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do CDC para detecção do SARS-CoV-2, usando o RNA sintetizado do SARS-Cov-2 como modelo, diluído em 10⁵, 10⁴, 10³, 10² e 10 cópias. A amostra de teste continha o modelo, os reagentes de cada kit, primers de DNA específicos do alvo e conjuntos de sondas TaqMan^® para N1 e N2 (N, gene do nucleocapsídeo). As amostras NTC (sem controle de modelo) também foram incluídas em cada ensaio.

Primer alvo	Primer F 5'-3'	Primer R, 5'-3'	Sonda	Amplicon Tamanho
N1	GACCCCAAAATCAGCGAAAT	TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG	5'-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'	71 bp
N2	TTACAAACATTGGCCGCAAA	GCGCGACATTCCGAAGAA	5'-FAM-ACA ATT TGC CCC CAG CGC TTC AG-BHQ1-3'	67 bp

Tabela 2. Conjuntos de primers e sondas projetados para a detecção específica do SARS-CoV-2 (ensaios N1 e N2). Somente para fins de pesquisa. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Resultados de testes

A: Ensaio N1

B: Ensaio N2

Figura 2. Ensaios de detecção de SARS-CoV-2 utilizando o Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (Nº do cat. QR200) para alvos de primer N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B).

Os ensaios N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B) de detecção de SARS-CoV-2 na Figura 2 foram realizados com Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (Nº do cat. QR200) usando RNA sintetizado de SARS-CoV-2 como modelo. Ambos os ensaios mostraram sensibilidades para detectar até 10² cópias do modelo. Não foi observada amplificação com amostras NTC

A: Ensaio N1

B: Ensaio N2

Figura 3. Ensaios de detecção de SARS-CoV-2 utilizando o KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Nº do cat. KCQS07) para alvos de primer N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B).

Os ensaios de detecção de SARS-CoV-2 N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B) na Figura 3 foram realizados com KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Nº do cat. KCQS07) usando RNA sintetizado de SARS-CoV-2 como modelo. Ambos os ensaios mostraram sensibilidades para detectar até 10 cópias do modelo. Não foi observada amplificação com amostras NTC.

A: Ensaio N1

B: Ensaio N2

Figura 4. Ensaios de detecção de SARS-CoV-2 utilizando o KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) Universal Kit (Nº do cat. KK4752) para alvos de primer N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B).

Os ensaios N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B) de detecção do SARS-CoV-2 na Figura 4 foram realizados com o KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) Universal Kit (Nº do cat. KK4752) usando RNA sintetizado do SARS-CoV-2 como modelo. Ambos os ensaios mostraram sensibilidades para detectar até 10² cópias do modelo. Não foi observada amplificação com amostras NTC.

A: Ensaio N1

B: Ensaio N2

Figura 5. Ensaios de detecção de SARS-CoV-2 utilizando o ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Nº do cat. RK20407) para alvos de primer N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B).

Os ensaios N1 (gráfico A) e N2 (gráfico B) de detecção do SARS-CoV-2 na Figura 5 foram realizados com o ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (Nº do cat. RK20407) usando RNA sintetizado do SARS-CoV-2 como modelo. Ambos os ensaios mostraram sensibilidades para detectar até 10 cópias do modelo. Não foi observada amplificação com amostras NTC.

Conclusão

Os resultados acima indicam que nossos reagentes e kits One-Step RT-qPCR são ideais para a detecção do alvo SARS-CoV-2 em pesquisas sobre o SARS-CoV-2. Com base nessas informações, os ensaios que usam os reagentes One-Step RT-qPCR podem detectar até 100 cópias ou, em alguns casos, até 10 cópias do modelo de RNA.

Somente para fins de pesquisa. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Os dados não publicados apresentados neste artigo técnico são provenientes de pesquisa interna.

Para obter mais informações sobre os produtos RT-qPCR para detecção de SARS-CoV-2, acesse Sigma-Aldrich.com/covid19

Reagente TRI^® para isolamento de RNA total

O reagente TRI^® é ideal para o isolamento rápido, econômico e eficiente de RNA total ou isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteínas de amostras de origem humana, vegetal, de levedura, bacteriana e viral.

Este produto, uma mistura de tiocianato de guanidina e fenol e solução monofásica, dissolve efetivamente DNA, RNA e proteínas na homogeneização ou lise de amostras de tecido. Após a adição de clorofórmio ou 1-bromo-3-cloropropano e centrifugação, a mistura se separa em 3 fases: uma fase aquosa, contendo o RNA, uma fase intermediária, contendo DNA e uma fase orgânica, contendo proteínas. Cada componente pode, então, ser isolado após a separação das fases. Um ml do reagente TRI^® é suficiente para isolar RNA, DNA e proteínas de 50-100 mg de tecido, 5-10 * 106 células, ou 10 cm² de superfície de placa de cultura para células cultivada em monocamada.

Este é um dos métodos mais eficazes para isolamento de RNA total e pode ser realizado em apenas 1 hora, começando com tecido ou células frescas. O procedimento é bastante eficaz para isolar moléculas de RNA de todos os tipos, a partir de um comprimento de 0,1-15 kb. O RNA resultante fica intacto, com pouca ou nenhuma contaminação por DNA e proteínas. Pode ser usado para Northern blot, isolamento de RNAm, tradução in vitro , ensaio de proteção com RNase, clonagem e PCR.

O TRI Reagent^® tem sido amplamente utilizado na inativação de vírus e na extração de RNA viral para a detecção do SARS-CoV-2 por ensaios de RT-qPCR em vários estudos de pesquisa.^{1, 2, 3} Ele demonstrou ser ideal para o isolamento e o armazenamento de mi-RNA a -80⁰C por períodos prolongados.⁴ Foi usado na extração de RNA de coronavírus felino e canino, que é posteriormente usado em ensaios de RT-PCR.^{5, 6} Também foi usado para isolar RNA citoplasmático de células Vero infectadas com SARS-CoV. ⁷

Nº. do cat.	Nome do produto	Características
T9424	Reagente TRI®	Para processar tecidos, células cultivadas em monocamadas ou pellets de células

Somente para fins de pesquisa. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.

Referências

1. Dimke H, Larsen SL, Skov MN, Larsen H, Hartmeyer GN, Moeller JB. Phenol-chloroform-based RNA purification for detection of SARS-CoV-2 by RT-qPCR: comparison with automated systems. https://doi.org/10.1101/2020.05.26.20099440

2. Alhamlan F, Alqahtani A, Bakheet D, Bohol M, Althawadi S, Mutabagani M, Almaghrabi R, Obeid D. Development and Validation of Two In-house, Low-Cost SARS-CoV-2 Detection Assays. https://doi.org/10.1101/2020.05.18.20105510

3. Toptan T, Hoehl S, Westhaus S, Bojkova D, Berger A, Rotter B, Hoffmeier K, Cinatl J, Ciesek S, Widera M. Optimized qRT-PCR Approach for the Detection of Intra- and Extra-Cellular SARS-CoV-2 RNAs. IJMS. 21(12):4396. https://doi.org/10.3390/ijms21124396

4. Mraz M, Malinova K, Mayer J, Pospisilova S. 2009. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390(1):1-4. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.09.061

5. Gunn-Moore DA, Gruffydd-Jones TJ, Harbour DA. 1998. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology. 62(3):193-205. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00210-7

6. Erles K, Toomey C, Brooks HW, Brownlie J. 2003. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology. 310(2):216-223. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00160-0

7. Darnell ME, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR. 2004. Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. Journal of Virological Methods. 121(1):85-91. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2004.06.006

*Este artigo é uma pré-impressão e não foi revisado por pares. Ele relata novas pesquisas médicas que ainda não foram avaliadas e, portanto, não devem ser usadas para orientar a prática clínica.