Resolução de problemas de RT-PCR / RT-qPCR

Nesta página

• Desenvolvimento de um protocolo de resolução de problemas
• Otimização do design de oligonucleotídeo
  
• Otimização do ensaio de PCR
• Modelo de ensaio de RT-PCR e qPCR
  
• Qualidade do molde de RNA ou DNA
  
• Programa de ensaio PCR
• Mau funcionamento do termociclador
• Exemplos de resolução de problemas: Ferramentas de diagnóstico
• Curvas de dissociação/fusão
• Estudos de caso de resolução de problemas de RT-PCR
• Resumo - Lista de verificação de resolução de problemas de PCR

Desenvolvimento de um protocolo de resolução de problemas de PCR ou RT-PCR

Possíveis fontes de erro e/ou problemas de erro do operador

Há muitas possibilidades de erro do operador. As fontes desses erros geralmente não são identificadas. A primeira etapa de qualquer procedimento de resolução de problemas é verificar o protocolo e repetir o experimento. É importante verificar o protocolo (consulte o Apêndice A, Protocolos, deste guia) e pedir a um biólogo molecular experiente que revise o plano experimental. A história de advertência do pós-doutorando que executou várias PCRs com falhas antes de perceber que os dNTPs estavam faltando na mistura-mestre de PCR é um lembrete de que até mesmo os melhores cientistas, que trabalham demais, são vulneráveis a erros simples.

Mistura-mestre

Erros ou problemas com a mistura-mestre dos componentes da reação podem ser a fonte de uma falha catastrófica de amplificação em todas as amostras e controles positivos. Antes de repetir o experimento, verifique todos os componentes e suas concentrações. Se um novo lote de reagente estiver sendo usado, é uma precaução útil comparar o novo com o antigo antes de iniciar uma grande série de experimentos. 

Ao trocar os produtos da mistura-mestre, é fundamental reconhecer que alguns ensaios são particularmente sensíveis às combinações de composição do tampão/temperatura de hibridização (T_a)/concentração do primer. A alteração de qualquer um desses itens pode resultar em um desempenho diferente. Portanto, verifique todos os ensaios em misturas-mestre selecionadas e em todos os instrumentos desejados antes de fazer alterações radicais. Também é essencial revisar as instruções fornecidas com cada mistura-mestre, pois elas especificam as condições recomendadas que são otimizadas para a enzima em questão, o mecanismo Hot Start e os componentes do tampão.  

Problema	O JumpStart™ Taq ReadyMix™ não funciona tão bem quanto um produto similar de um fornecedor diferente
Possíveis causas	Uma incubação inicial incorreta de 95 °C por 15 min foi usada como protocolo de Hot Start/desnaturação antes do ciclo (aplicando inadequadamente um protocolo padrão de Hot Start convencionalmente usado para enzimas quimicamente inativadas). As condições de otimização do primer diferem ligeiramente entre os ReadyMixes.
Teste diagnóstico	Verifique o perfil de termociclagem. Verifique se as condições de reação são ideais para os primers.
Solução	Uma incubação inicial de 3 min a 94 °C é suficiente para ativar a Taq JumpStart ; incubações mais longas inativarão parcialmente a enzima (protocolo Hot Start específico para a Taq JumpStart inativada por anticorpos). Ajuste a concentração do primer ou a temperatura de hibridização (Ta).

Problema	O PCR ReadyMix funciona para PCR, mas não para qPCR, mas produtos equivalentes de um fornecedor diferente funcionam bem
Possíveis causas	O REDTaq® ReadyMix foi usado para qPCR em tempo real. Uma ReadyMix que não contém um corante de referência foi usado em um instrumento que exige um corante de referência ou foi incluída uma concentração inadequada . Uma ReadyMix projetado para uso com sondas foi usado sem incluir uma sonda na reação.
Teste diagnóstico	Verifique a escolha de ReadyMix e a cor da mistura qPCR.
Soluções	Use ReadyMixes apropriadas para a aplicação de PCR desejada. O corante vermelho interfere na detecção de fluorescência na maioria dos instrumentos de qPCR.

É uma boa prática de laboratório garantir que seja preparada uma mistura-mestre de reação suficiente para todas as amostras que serão executadas juntas. Certifique-se de que todos os componentes estejam cuidadosamente descongelados e bem misturados e que a mistura-mestre do experimento esteja muito bem misturada antes de aliquotar as amostras. Isso é particularmente relevante para alguns dos tampões 2×, como o KiCqStart^® , que são mais viscosos do que os tampões normais de PCR.

Otimização de oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos podem causar problemas se tiverem uma sequência incorreta ou forem mal projetados, se forem executados em uma concentração abaixo do ideal, em uma Ta abaixo do ideal ou se forem marcados ou atenuados de forma inadequada (para sondas). Um ensaio executado em condições abaixo do ideal para o oligo, ou usando um design inadequado, pode produzir alguns dados, mas isso pode não refletir a biologia genuína em consideração. Ao receber um oligonucleotídeo liofilizado, é fundamental:

1. Verificar a sequência
   
2. Garantir que todo o DNA seja novamente suspendido antes do uso
   
3. Confirmar se a resolução tem a concentração esperada
   

Suspender novamente os oligonucleotídeos aquecendo-os a 90 °C por 5 minutos e misturando-os bem. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento também podem afetar o desempenho dos oligonucleotídeos e, portanto, todos os oligonucleotídeos em uma concentração de estoque (geralmente 100 μM) devem ser aliquotados e armazenados a -20 °C ou -80 °C a longo prazo.

Durante a fase de resolução de problemas, é fundamental verificar se a sequência correta foi solicitada, retornando à sequência-alvo e confirmando que as sequências de oligonucleotídeos estão de fato presentes. Verifique se a qualidade do oligonucleotídeo estava correta entrando em contato com o fornecedor do oligonucleotídeo. Meça a concentração de trabalho do oligonucleotídeo e inspecione visualmente as moléculas fluorescentes para confirmar que elas estão marcadas. Teste os primers dos ensaios de sonda em uma mistura de qPCR SYBR^® Green I para verificar a amplificação. Considere otimizar as concentrações de primers ou T_a (consulte Otimização e validação de ensaios). Ao usar uma sonda pela primeira vez, colete dados fluorescentes para o maior número possível de comprimentos de onda, de modo que qualquer possível vazamento de sinal entre os canais seja observado e erros na marcação possam ser detectados.

Otimização inadequada de PCR

O efeito da otimização do ensaio foi descrito e demonstrado em Otimização e validação de ensaios. Quando um ensaio falha ou tem desempenho subótimo, mas não há erros no design ou nos procedimentos operacionais, ele pode se beneficiar da otimização das condições experimentais. Ao solucionar problemas, teste os primers em concentrações finais de 100 nM, 500 nM e 900 nM e/ou T_a entre 55 °C e 70 °C (usando um gradiente de temperatura) para identificar se o ensaio melhorará com otimização adicional.

Modelo de ensaio de RT-PCR e qPCR

O modelo do ensaio foi descrito em Modelo de ensaio PCR/qPCR/dPCR. Ao solucionar problemas de um ensaio, certifique-se de que o design tenha sido verificado. Confirme se o primer de PCR/qPCR e a posição do amplicon estão de acordo com o protocolo de primer de RT. Por exemplo, certifique-se de que os ensaios aplicados ao cDNA que foi preparado após a preparação do oligo-dT estejam situados na direção do ponto 3' da transcrição. Certifique-se de que as informações da sequência sejam confiáveis e que as variantes de emenda e os SNPs apropriados tenham sido considerados.

Problema	O ensaio é insensível e os gráficos de amplificação parecem anormais (Figura 11.1)
Possíveis causas	O modelo do ensaio é inadequado. A sonda não está identificada adequadamente. O ensaio requer otimização.
Teste diagnóstico	Verifique o modelo do ensaio (solicite uma revisão do modelo à nossa equipe técnica de produtos personalizados). Verifique as leituras de fluorescência de fundo nos dados brutos/ gráficos multicomponentes. Verificar a otimização.
Soluções	No exemplo mostrado na Figura 11.1A, a verificação do modelo do ensaio revela um design de sonda com estrutura secundária significativa que levaria aos efeitos observados (Figura 11.1B). A resolução ideal é reprojetar o ensaio, se possível. Quando absolutamente necessário, os designs que exigem oligonucleotídeos com estrutura secundária podem ser salvos pela adição de <10% do volume final da reação de betaína ou DMSO aos tampões de reação e otimização adicional.

Figura 11.1A. O ensaio tem um perfil de gráfico de amplificação incomum com um desvio pronunciado da linha de base.

Figura 11.1B. A sequência da sonda que foi incluída no ensaio foi inserida no software de previsão de dobragem mfold. Está claro que a sonda pode adotar uma estrutura dobrada estável em resolução e é provável que isso resulte no problema observado.

Qualidade do molde de RNA ou DNA

O efeito da qualidade do modelo no desempenho do ensaio foi descrito em Purificação de amostras e avaliação da qualidade. A qualidade do modelo abrange a consideração da quantidade, da integridade e da presença de inibidores. É fundamental garantir que a qualidade do RNA seja compatível com o protocolo de preparação de RT mais adequado (consulte Transcrição reversa) e usar o modelo da melhor qualidade possível. Da mesma forma, a quantidade de RNA que é adicionada às reações de RT deve estar dentro do escopo do protocolo e, em muitos casos, deve ser a mesma para todas as reações. O ReadyScript^® é uma exceção notável a essa diretriz porque a adoção desse reagente e do protocolo produz uma concentração linear de cDNA que é proporcional à quantidade de RNA de entrada. Ao solucionar problemas de uma amostra que esteja produzindo um C_q maior do que o esperado, execute o ensaio SPUD ou dilua a amostra em uma série de diluições de 1:5 ou 1:10 e repita o ensaio (Figura 11.2) para identificar amostras que contenham inibidores.

Problema	Os dados de Cq para diluições da curva padrão estão irregularmente espaçados (Figura 11.2)
Possíveis causas	O modelo do ensaio é inadequado, levando a uma preparação ineficiente. Há erros nas diluições do modelo para a curva padrão. A amostra contém um inibidor.
Teste diagnóstico	Verifique o ΔCq entre cada diluição (a Tabela 11.1 mostra os dados de interpretação da Figura 11.2). Verifique o modelo do ensaio. Repita o ensaio em uma diluição em série recém-preparada.
Soluções	O ΔCq entre cada diluição dos dados mostrados na Figura 11.2 diminui, tendendo para os 3,3 ciclos esperados para uma diluição de 10 vezes (Tabela 11.1). Isso indica que a amplificação se torna mais eficiente quando o modelo diluído é usado, uma observação que é consistente com o fato de a amostra conter um inibidor.

Figura 11,2. Amplificação de uma diluição em série de 10 vezes de um molde de DNA. As réplicas são precisas, mas o ΔCq é inconsistente, diminuindo com o aumento das diluições. Os dados também mostram um sinal positivo no controle sem modelo (NTC), indicando contaminação ou formação de dímero de primer, e que as diluições para menos de 105 cópias têm dados idênticos aos do NTC.

Tabela 11,1 Diferenças de Cq registradas para uma diluição seriada de 10 vezes do modelo (mostrado na Figura 11.2)

Diluição	ΔCq
107 → 106	5,4
106 → 105	5,0
105 → 104	3,6

A quantidade de modelos também é uma consideração importante. A inclusão de um modelo muito grande ou muito pequeno na PCR resultará em reações fracassadas e gráficos de amplificação de qPCR que parecem anormais. A Figura 11.3A mostra uma reação contendo uma diluição em série de 10 vezes do modelo de oligonucleotídeo artificial. As diluições mais baixas são muito concentradas para que a reação seja eficiente ou para que o instrumento processe efetivamente os dados da linha de base (Figura 11.3B), resultando em gráficos de amplificação anormais e dados não confiáveis.

Figura 11.3. A) Amplificação de uma diluição em série de 10 vezes de um modelo artificial com primers específicos e uma sonda marcada com FAM. O Cq é muito baixo para as amostras concentradas, os gráficos de amplificação não são espaçados regularmente e são anormais. B) Mostra os dados brutos para esses gráficos de amplificação. As reações que contêm a maior concentração de alvo também apresentam uma fluorescência de fundo significativamente maior e um rendimento mínimo de fluorescência durante a reação.

Programa de ensaio PCR

As condições de ciclos da PCR devem ser adequadas tanto para o experimento quanto para os reagentes (por exemplo, consulte Mistura-mestre). Não é aconselhável aceitar as configurações padrão do instrumento sem verificação.

Mau funcionamento do termociclador

As falhas do instrumento podem ter um início insidioso e, portanto, podem ser difíceis de diagnosticar. Para evitar custos de reparo elevados, certifique-se de que todos os operadores de instrumentos sejam totalmente treinados e inicialmente supervisionados. Algumas falhas de instrumentos causam falhas catastróficas, resultando na ausência de amplificação ou de dados fluorescentes, enquanto outras distorcem os dados ou tratam as amostras de maneira não uniforme, criando diferenças artificiais entre amostras biológicas idênticas. O uso de amostras de controle com ensaios de controle é inestimável para a resolução de problemas. Quando se suspeita de uma falha no instrumento, um ensaio confiável e otimizado deve ser executado em todos os poços. Essa verificação de uniformidade revelará problemas específicos de regiões do instrumento, bem como problemas separados do ensaio e do instrumento.

Exemplos de resolução de problemas de PCR que demonstram o uso das ferramentas de diagnóstico

Depois de executar uma PCR bem planejada, há várias ferramentas de diagnóstico disponíveis para a resolução de problemas:

• Amostras de controle e ensaios
  
• Gel de ponto final/Reagente de corante SYBR Green I
• Gráficos de amplificação (verifique as réplicas e o perfil do gráfico de amplificação)
  
• Curvas padrão (gradiente e R2)/série de diluição
  
• Gráficos de fusão/dissociação (corante SYBR Green I, Molecular Beacons (“faróis” moleculares), sondas Scorpions^®)
  
• Visualizações de dados brutos/multicomponentes

Amostras/Reações de controle

O uso de controles é altamente recomendado. É quase impossível resolver um ensaio com falha sem informações de um conjunto apropriado de controles.

Controle	Exemplo de material	Resultado esperado	Possíveis razões para um resultado positivo	Possíveis razões para um resultado negativo
Amostra positiva	Uma amostra conhecida por conter as sequências do ensaio , por exemplo, RNA/ gDNA expressando/contendo o alvo	Positivo	Correto	Falha no ensaio. Qualquer dado positivo de outras amostras não é confiável.
Controle positivo do ensaio	Qualquer ácido nucleico compatível com o modelo do ensaio de PCR, por exemplo, oligonucleotídeo artificial ou plasmídeo que contenha o amplicon de PCR.	Positivo	Correto	Falha no ensaio. Qualquer dado positivo de outras amostras não é confiável.
Controle negativo	Uma amostra que sabidamente não contém as sequências do ensaio, por exemplo, RNA/gDNA que não expressa/não contém o alvo.	Negativo	O ensaio não é específico ou houve contaminação do controle durante a preparação da PCR	Correto
Contaminação Controle negativo do ensaio (Sem controle de modelo, em inglês "No Template Control" NTC)	Água	Negativo	Os primers são autodimerizados, resultando em um produto dimerizado de primer, ou houve contaminação do controle durante a preparação da PCR.	Correto

Controles específicos de RT	Exemplo de material	Resultado esperado	Possíveis razões para um resultado positivo	Possíveis razões para um resultado negativo
Controle negativo da enzima RT Minus	Amostra de RNA e todos os componentes da reação de RT, com exceção da enzima de RT. Isso deve ser realizado em todas as amostras para verificar se elas não contêm sequências que se amplificam sob as condições de PCR sem a necessidade de RT, por exemplo, contaminação por gDNA	Negativo	A amostra contém gDNA. A reação foi contaminada durante a preparação. Os primers formaram produtos de dímeros de primers. Analisar em conjunto com o NTC	Correto

Específico para genotipagem	Exemplo de material	Resultado esperado	Possíveis razões para um resultado positivo	Possíveis razões para um resultado negativo
Alvo positivo específico do ensaio.	Modelo do tipo selvagem (WT) detectado com o ensaio WT e alvo mutante detectado com o ensaio mutante.	Positivo	Correto	Ocorreu um erro durante a preparação do ensaio. O ensaio precisa ser projetado novamente. Há um problema com um dos oligonucleotídeos componentes. O ensaio requer otimização adicional
Alvo de negatividade específico do ensaio	Modelo WT detectado com ensaio mutante e alvo mutante detectado com ensaio WT.	Negativo (ou Cg relativamente alto em comparação com o controle positivo).	A reação foi contaminada durante a preparação. O ensaio é inespecífico e requer otimização ou novo design.	Correto
Controle de heterozigotos do ensaio	Modelo heterozigoto ou uma mistura 1:1 de cada homozigoto detectado com o ensaio WT e com o ensaio mutante.	Positivo em ambos os ensaios.	Correto	Ocorreu um erro durante a preparação do ensaio. O ensaio precisa ser projetado novamente. Há um problema com um dos oligonucleotídeos componentes. O ensaio requer otimização adicional. Analise os resultados juntamente com controles de modelo/ensaio único.

Problema	O controle positivo amplifica, mas não há resultados de amplificação de uma amostra conhecida por conter o alvo (Figura 11.4A)
Possíveis causas	Concentração inadequada da amostra. Inibição na amostra de teste.
Teste diagnóstico	Teste a amplificação com uma amostra diluída. Faça o pico da reação com um nível baixo de alvo exógeno e teste a amplificação do alvo exógeno (consulte Transcrição reversa; siga o Protocolo SPUD, Apêndice A).
Soluções	Adicione até 0,3% de BSA à PCR (Figura 11.4B) ou purifique o ácido nucleico de entrada.

Figura 11.4. A) O modelo não diluído não consegue amplificar, enquanto as diluições mostram uma maior eficiência de amplificação. B) A adição de 0,3% de BSA à mistura de qPCR favorece a amplificação a partir do modelo não diluído.

As investigações sobre um ensaio completamente com falha podem ser difíceis porque há poucas informações para trabalhar na resolução de problemas. Como muitas falhas de ensaio são resultado de algum erro catastrófico, a primeira verificação deve ser a configuração do experimento e, em seguida, repetir a PCR. Se isso falhar, o processo de resolução de problemas dependerá das informações sobre cada componente do experimento (Figura 11-5).

Figura 11.5. O processo básico de resolução de problemas para PCR.

Quando um experimento de qPCR falha completamente, a primeira etapa é verificar o design do ensaio, as sequências de oligonucleotídeos e os dados de CQ do fabricante dos oligo. Embora o ensaio possa ter falhado, os dados de qPCR multicomponentes/brutos podem ser usados para fornecer mais informações. A Figura 11.6A mostra o gráfico de dados brutos para dois ensaios contendo uma sonda marcada com 6-FAM™ ou HEX™ (VIC^®). Embora ambos os ensaios mostrem amplificação, o sinal HEX é aproximadamente a metade do sinal FAM. Como esse é um corante inerentemente mais fraco, essa é uma observação normal. A análise do gel de agarose (Figura 11.6B) mostra que ambas as reações geram uma concentração semelhante de produtos, apoiando a observação de que os valores de C_q da qPCR são semelhantes.

Figura 11.6. A) Os gráficos de dados brutos de um ensaio duplex contendo uma sonda FAM e uma sonda marcada com HEX. A sonda FAM produz naturalmente maior fluorescência. B) O gel de agarose mostra que quantidades iguais de produto foram produzidas em cada reação e confirma a observação do qPCR Cq.

O exame dos dados brutos é uma verificação útil para verificar se a sonda está rotulada corretamente e se foi adicionada à reação. A Figura 11.7 mostra os dados brutos da amplificação de três alvos em um experimento triplex. As sondas específicas para cada alvo são marcadas com FAM, HEX e TAMRA. As sondas HEX e TAMRA mostram um fundo baixo e uma amplificação eficiente, mas o sinal FAM é consistentemente alto durante todo o experimento e não há evidência de amplificação. Isso é consistente com uma concentração muito alta da sonda na reação ou com uma falha na sonda, de modo que não há extinção inicial do sinal. Nesses casos, a concentração da sonda e o modelo do ensaio devem ser verificados, garantindo que a sonda tenha um rótulo e um redutor compatíveis e, se necessário, que uma nova sonda seja testada.

Figura 11.7. Uma reação triplex foi usada para detectar três alvos usando sondas marcadas com FAM, HEX e TAMRA. As sondas HEX e TAMRA produziram amplificação dos alvos, mas a sonda FAM não apresentou amplificação. O exame dos dados brutos revelou que a fluorescência de fundo era excepcionalmente alta e nenhuma diferença foi observada durante a reação. Isso é consistente com uma concentração muito alta da sonda na reação ou com uma sonda defeituosa com extinção inadequada.

Se o experimento original se baseou na detecção de sonda, o ensaio deve ser repetido usando reagentes SYBR Green I, incluindo um controle positivo e um negativo (mas não amostras preciosas). Como alternativa, os produtos de uma reação com falha podem ser verificados em um gel de agarose corado com brometo de etídio. A adoção da abordagem SYBR Green I para a repetição do experimento é preferível porque evita o risco de contaminação e fornece um experimento repetido para verificar a falha inicial. Se o experimento SYBR Green I fornecer dados, é possível que a falha da sonda original tenha sido causada por um erro técnico ou por uma falha na sonda. Para diferenciar entre um erro experimental ou uma falha na sonda, repita o experimento com a sonda; se a reação falhar novamente, substitua a sonda. Essa abordagem pode ser adotada para investigar reações que estejam produzindo dados ruins. No exemplo mostrado na Figura 11.8, a reação da sonda estava abaixo do ideal e, quando comparada com a reação executada usando SYBR Green I, pode-se ver que o sinal da sonda não reflete o experimento. Nesses casos, o modelo do ensaio deve ser verificado e uma nova sonda deve ser testada.

Figura 11.8. Reações idênticas foram executadas com uma sonda qPCR ou corante SYBR Green I (conforme indicado). A reação SYBR Green I foi aproximadamente onze ciclos mais sensível e produziu uma fluorescência de ponto final muito maior. Isso indica uma falha na sonda ou um problema com o design da sonda (dados gentilmente fornecidos pelo Prof. Stephen Bustin, Reino Unido).

Validação da marcação da sonda

Os dados brutos ou o gráfico de multicomponentes são uma ferramenta de diagnóstico útil para investigar se a concentração adequada da sonda foi incluída na reação e se a sonda foi adequadamente marcada e extinta. A Figura 11.9 mostra o gráfico multicomponente para uma reação contendo três sondas. Os dois primeiros geram gráficos de amplificação e a fluorescência de fundo é evidente. Não há dados da terceira sonda e um exame dos dados brutos revela que a fluorescência de fundo é equivalente ao controle em branco da água, que não contém nenhuma sonda. Portanto, esses dados são o resultado da ausência de fluorescência na reação. Isso pode ser devido a um erro durante a configuração em que a sonda não foi incluída ou em que a sonda não foi etiquetada.

Figura 11.9. Três genes foram detectados na mesma amostra modelo. Duas reações resultaram em amplificação (1 e 2), mas a terceira foi negativa. Um exame da visualização de multicomponentes revela que a fluorescência de fundo para a terceira reação é equivalente ao controle de água, indicando uma ausência de sinal.

Uma verificação adicional da marcação da sonda pode ser realizada usando uma digestão com DNase I. Isso deve ser feito com extremo cuidado para garantir que os estoques de sondas e primers não sejam contaminados com enzimas, o que levaria a resultados catastróficos. Uma alíquota de uma sonda com falha (Figura 11.10A) equivalente à incluída em uma reação, por exemplo, 300 nM, é incubada com e sem DNase I. Isso pode ser feito em tempo real (Figura 11.10B), de modo que o rendimento fluorescente seja medido em relação ao tempo ou, alternativamente, a leitura do ponto inicial e final (após 10 minutos) fornece informações suficientes. Ao realizar esse teste, é importante comparar os dados com uma sonda que esteja funcionando bem e que tenha o mesmo marcador fluorescente e redutor (Figura 11.10B). 

Figura 11.10. A) Dois modelos foram detectados usando sondas diferentes, ambas marcadas com FAM. Enquanto a detecção usando uma sonda resultou em um sinal fluorescente alto, a segunda foi muito mais fraca. B) Um controle e uma sonda de teste (300 nM) foram incubados a 37 °C em um instrumento em tempo real no tampão DNase I na presença ou ausência da enzima DNase I. A liberação fluorescente da sonda 1 foi aproximadamente o dobro da sonda 2, demonstrando que a marcação da sonda 2 era inadequada.

Problema	Fluorescência baixa ou ausente na amostra de teste e no controle positivo. O produto de PCR correto é visível no gel e o design é verificado
	Detecção baseada em corante SYBR Green	Detecção de sonda
Possível causa	Corante de ligação SYBR Green I ruim.	Fluorescência de fundo alta/baixa. Concentração incorreta da sonda.	Sonda degradada. Rotulagem deficiente da sonda. Coleta incorreta de dados fluorescentes.
Teste diagnóstico	Compare a fluorescência da mistura do corante de ligação SYBR Green I ±1 μg de DNA. A fluorescência deve ser pelo menos 10.000 unidades maior com o DNA adicionado do que sem ele.	Verifique a fluorescência bruta (gráfico multicomponente). A fluorescência deve aumentar pelo menos 10.000 unidades entre os ciclos 1 e 40.	Digira 5 fmoles de sonda com DNase I. Colete o rendimento fluorescente usando todos os comprimentos de onda. A fluorescência deve ser pelo menos 10.000 unidades maior do que sem a digestão com DNase.
Soluções	Adquira um novo corante de ligação SYBR Green I ou uma nova mistura qPCR com corante de ligação SYBR Green.	Use a concentração correta. Adquira uma nova sonda.	Adquira uma nova sonda.

Gráficos de amplificação

A estrutura dos gráficos de amplificação e a reprodutibilidade das réplicas técnicas fornecem uma grande quantidade de informações sobre a qualidade do ensaio de qPCR e também podem fornecer as primeiras indicações de alerta de que nem tudo está como deveria estar. Os gráficos de amplificação na Figura 11.11A não são típicos, são muito ruidosos e seriam difíceis de interpretar com precisão. Um exame mais aprofundado dos valores de fluorescência dR revela que o rendimento fluorescente do ponto final é de apenas 400 unidades, indicando que a reação é inadequada, mas os gráficos de amplificação foram gerados pelo software do instrumento e dimensionados automaticamente. Da mesma forma, os dados da Figura 11.11B têm uma cauda de raposa pronunciada (curva decrescente) no início do perfil, antes de aumentar novamente após uma seção de linha de base. A aparência da cauda de raposa é consistente em duas reações, mas uma reação tem um ponto final muito mais baixo (Figura 11.11C), resultando em uma cauda de raposa amplificada e relativa.

Figura 11.11. A) Gráficos de amplificação com ruído devido ao escalonamento automático pelo software do instrumento de dados ruins com baixa fluorescência. B) As reações que produzem um ponto final baixo dR têm uma cauda de raposa inicial pronunciada. C) O rabo de raposa é visto como um efeito normal quando comparado ao ensaio de alta qualidade.

Da mesma forma, os gráficos de amplificação na Figura 11.12A são claramente anormais e não podem ser usados da forma como são apresentados. Um gráfico de amplificação que fica abaixo de zero dR (Figura 11.12A) é uma indicação clássica de que foram aplicadas configurações de linha de base inadequadas. O exame dos dados brutos dessa reação (Figura 11.12B) mostra que os gráficos de amplificação reais têm um perfil normal, confirmando que os dados analisados são o resultado de um problema de software do instrumento. A linha de base apropriada pode ser deduzida dos dados brutos e aplicada no software. Nesse caso, os ciclos 6 a 16 representam a fase inicial linear e de linha de base da reação e, quando aplicados, resultam em gráficos de amplificação normais (Figura 11.12C).

Figura 11.12. A) Os gráficos de amplificação eram claramente anormais, com uma seção do perfil caindo abaixo da linha de base. B) O exame do gráfico de dados brutos revela que os dados da reação estão de acordo com o esperado. C) A configuração da linha de base do instrumento de acordo com os ciclos apropriados restaura o perfil normal dos dados dos gráficos de amplificação analisados.

O perfil do gráfico de amplificação também pode ser interpretado para fornecer informações sobre a qualidade do ensaio e a otimização. A Figura 11.13 mostra a tentativa de amplificação de uma diluição serial de 10 vezes do modelo com cada concentração executada em qPCR duplicada. A reprodutibilidade entre réplicas é ruim, a diferença de ciclo (ΔC_q) entre os dados não é constante e não é de 3,323 ciclos, como esperado para uma diluição em série de 10 vezes. O exame dos gráficos de amplificação, considerando que se trata de uma curva padrão, revela que o ensaio está abaixo do padrão e não pode ser usado para análise. Os motivos precisariam de uma investigação mais aprofundada, mas poderiam ser o resultado de: modelo de ensaio inadequado (consulte Modelo de ensaio PCR/qPCR/dPCR), condições de ensaio abaixo do ideal (consulte Otimização e validação do ensaio) ou pipetagem inadequada (ensaio repetido).

Figura 11.13. Uma amostra de cDNA foi diluída por meio de uma diluição em série de 10 vezes e o modelo específico foi detectado usando qPCR duplicado para cada diluição. As réplicas são ruins, indicando um problema com a pipetagem ou com a otimização do ensaio.

Problema	Os gráficos de fluorescência aumentam repentinamente (Figura 11.14).
Possíveis causas	Corante de referência ruim ou erro do instrumento (por exemplo, a porta foi aberta durante a execução).
Teste diagnóstico	Desative a normalização do corante de referência ou examine os resultados para ΔR (aumento da fluorescência do ciclo 1 ao 40) em vez de ΔRn (o aumento relativo da fluorescência após a normalização para a intensidade do corante repórter). Para instrumentos que podem tolerar a análise sem o corante de referência, os gráficos devem ser corrigidos se a fluorescência não for normalizada para um corante de referência inativo. Os picos em dados brutos ou ΔR indicam um erro do instrumento.
Soluções	Gráficos de amplificação ΔR suaves: Adquirir um novo corante de referência. Sempre proteja o corante da luz durante o armazenamento. O pico persiste em ΔR: Repita a execução e, se o problema persistir, procure ajuda de engenharia para o instrumento.

Figura 11.14. Durante uma qPCR padrão, os dados aumentam repentinamente com um perfil não típico.

Problema	Gráficos de fluorescência em declínio ou em gancho (Figura 11.15)
Possíveis causas	À medida que o produto de PCR se acumula, a fita complementar compete com o primer e/ou a sonda para se unir ao modelo.
Teste diagnóstico	Consulte a Figura 11.15.
Soluções	Desconsidere-a se o Cq não for afetado.

Figura 11.15. No caso de gráficos de fluorescência decrescentes ou com gancho, a possível causa pode ser o fato de a fita complementar competir com o primer e/ou a sonda para o hibridização do modelo. Ignorar, desde que o Ct não seja afetado

Curvas de dissociação/fusão

A análise de dissociação ou curva de fusão é executada após a qPCR e é uma ferramenta de análise usada em conjunto com corantes de ligação ao DNA (como SYBR Green I) ou sondas não degradantes, como Molecular Beacons (“faróis” moleculares) ou sondas Scorpions^®, para verificar se um único produto foi amplificado. Após a amplificação da PCR, o amplicon resultante é incubado em temperaturas mais altas e as alterações no sinal fluorescente são detectadas conforme as transições do DNA entre os estados de fita dupla e fita simples. Quando a reação contém um único amplicon, ele se funde uniformemente e o gráfico de dF/dT (taxa de alteração da fluorescência em relação à temperatura) mostra um único pico. O exame da curva de fusão é particularmente eficaz quando combinado com dados de controles. A Figura 11.16A mostra o perfil de fusão pós qPCR para uma série de amostras de teste experimentais, o controle positivo e o controle sem modelo. O perfil de fusão das amostras de teste é idêntico ao do controle positivo e cada uma delas apresenta um único pico para a dF/dT. O perfil de fusão para o controle sem modelo tem um perfil mais amplo e uma T_m mais baixa. Essas observações são consistentes com a presença de dímeros de primers aparentes no controle negativo. Isso é confirmado com o uso de um gel de agarose corado com brometo de etídio (Figura 11.16B), que também mostra que os dímeros de primer se tornam aparentes quando o modelo está presente em baixa concentração. Isso causa uma superestimativa do alvo quando detectado em amostras de baixa concentração de alvo. Portanto, o ensaio deve ser otimizado ou reprojetado. Em contraste, a Figura 11.16C mostra que o perfil de fusão do produto no controle sem modelo é idêntico ao perfil de fusão do controle positivo e da amostra de teste. Essa é uma indicação clara de contaminação do controle sem modelo com modelo durante a configuração do experimento. O exemplo final demonstra o reconhecimento da amplificação do alvo do gDNA que está presente em uma amostra de cDNA (Figura 11.16D). O amplicon derivado do gDNA é mais longo e, portanto, tem uma
T_m mais alta do que a do cDNA.

Figura 11.16A. Um controle positivo, a reação de teste e o NTC foram amplificados e, em seguida, submetidos à análise de fusão pós-PCR. Há um produto evidente no NTC que derrete em uma temperatura mais baixa e com um pico de fusão mais amplo, consistente com a formação do dímero do primer.

Figura 11.16B. Os dímeros de primers são evidentes em uma resolução de gel dessas amostras (juntamente com outras), com a formação de dímeros de primers sendo inversamente proporcional à concentração do modelo de entrada.

Figura 11.16C. Um exemplo de aplicação da análise da curva de fusão para identificar a contaminação da reação no NTC.

Figura 11.16D. Identificação de um amplicon maior resultante da PCR do gDNA.

Problema	Vários picos de Tm em dados de perfil de fusão
	Produto único em um gel (Figura 11.17)	Vários produtos em um gel
Possíveis causas	Regiões localizadas ricas em AT ou GC ou repetições curtas no produto de PCR que causam o reencontro imperfeito do amplicon com perfis de fusão aparentemente diferentes.	Os primers não são específicos e estão produzindo vários produtos. A concentração de Mg2+ na reação é muito alta ou a temperatura de hibridização é muito baixa.
Teste diagnóstico	Verifique a sequência do amplicon quanto a regiões ou repetições ricas em AT ou GC.	Sequências de primer BLAST em relação à sequência do organismo de origem para verificar o alvo único.
Soluções	Isso não é um problema se a análise do gel mostrar que todo o produto é específico. Continue a usar os primers.	Titule o Mg2+ para determinar a concentração ideal. Realize o gradiente de temperatura de hibridização para selecionar a temperatura de hibridização ideal para a PCR. Projete primers exclusivos.

Figura 11.17. A) A) perfil de fusão e B) análise em gel de agarose de uma reação SYBR green I. Embora o perfil de fusão sugira produtos de Tm variável, a imagem do gel indica que um único amplicon está presente. Isso é indicativo de uma sequência de amplicon que contém regiões ricas em AT ou GC ou um elemento repetitivo que resulta em fusão irregular

Diluição em série do modelo/curvas padrão

Independentemente de o design experimental incluir a exigência de uma curva padrão para eventual quantificação, a detecção de uma diluição em série do modelo adequado é uma abordagem eficiente para a validação do ensaio e a resolução de problemas. A detecção de uma diluição em série permite que o intervalo dinâmico linear experimental do ensaio seja definido. A Figura 11.18A mostra uma curva padrão com pontos de dados de baixa concentração que não se ajustam ao perfil linear. O motivo mais comum para esse padrão de dados é a formação de dímeros de primers em amostras de baixa concentração (como mostrado na Figura 11.18B). Essa é a curva padrão gerada a partir dos dados mostrados na Figura 11.2. A Figura 11.18C mostra uma curva padrão com amostras altamente concentradas que caem fora da faixa linear. Os motivos mais comuns para isso são a inibição do modelo da reação ou o fato de as configurações da linha de base serem inadequadas.

Figura 11.18. A) Os pontos de dados relativos às concentrações mais baixas do alvo não se encontram na curva padrão. B) Isso é típico de uma reação que resulta em dímeros de primers, conforme ilustrado. Nesse caso, não há aumento observado no Cq para as amostras em baixa concentração.

Figura 11.18C. As amostras com altas concentrações de modelo não se encontram na curva padrão. Isso é típico de reações que são inibidas pela concentração do modelo ou devido à configuração incorreta da linha de base.

A curva padrão também é usada para medir a eficiência da reação em toda a faixa dinâmica das diluições. Deve-se tomar cuidado para garantir que todos os pontos usados nos cálculos de eficiência estejam sobre a linha. As reações devem ser tão próximas de 100% de eficiência quanto possível, e aquelas com eficiência aparentemente alta (>110%) ou baixa (<85%) devem ser investigadas mais a fundo.

Figura 11.19A. Um ácido nucleico modelo foi diluído em uma série de 10 vezes. Os gráficos de amplificação têm um gradiente anormalmente raso e o ΔCq é de 4 ciclos, em vez dos 3,3 esperados.

Figura 11.19B. O gradiente de um gráfico de curva padrão de Cq em relação à quantidade é usado para calcular a eficiência da reação.

Problema	A eficiência da PCR é maior que 120% (Figura 11.20)
Possíveis causas	Excesso de primer-dímero. A pipetagem é imprecisa. Inibição.
Teste diagnóstico	Avalie o gráfico de dissociação conforme mostrado na Figura 11.20. Teste a calibração da pipeta. Verifique o ΔCq entre diluições. Um inibidor na amostra é indicado se isso estiver diminuindo, confirme usando o ensaio SPUD (consulte o Apêndice A).
Soluções	Tente concentrações menores de primer. Com o RT-PCR, tente usar menos enzima RT, fazer duas etapas e/ou usar uma temperatura de incubação mais alta para a etapa RT. Verifique se as pipetas estão calibradas. Se as pipetas estiverem devidamente calibradas, pratique a pipetagem com precisão. Purificar a amostra. Use uma diluição maior no ensaio.

Figura 11.20A. Um ácido nucleico modelo foi diluído em uma série de 10 vezes. O ΔCq entre os gráficos de amplificação é de 1,5 ciclos em vez de 3,3.

Figura 11.20B. O gradiente de um gráfico de curva padrão de Cq em relação à quantidade é usado para calcular a eficiência da reação, que está próxima de 140%.

Figura 11.20C. Um exame do perfil da curva de fusão revela que as amostras de menor concentração (traços amarelo e azul) também contêm sinal de dímeros de primers amplificados (pico em Tm inferior).

Estudos de caso de resolução de problemas de RT-PCR

Um ensaio de sonda com falha

Um ensaio baseado em sonda foi projetado para detectar EIFB1 em amostras de cDNA humano, mas não mostra amplificação. As reações iniciais foram executadas em um instrumento ABi StepOne usando reagentes compatíveis. Foi feita uma tentativa de otimizar os primers usando uma faixa de concentrações de 200 nM a 900 nM (Figura 11.21), mas não houve melhora. O design do ensaio foi verificado e considerado apropriado para o alvo e, in silico, foi previsto que se tratava de um ensaio de alta qualidade. Novos primers foram sintetizados e executados juntamente com uma alíquota da síntese original usando um operador diferente, reagentes SYBR Green I (portanto, reagentes diferentes) e instrumento (um Eppendorf Realplex) (Figura 11.22). Ao adotar essa abordagem, tivemos em mente que o objetivo principal era resolver o problema, enquanto o objetivo secundário era explicar a falha. Essa reação produziu amplificação equivalente de ambos os lotes de primers. Nesse estágio, parecia que o problema da reação estava na sonda e, portanto, uma nova sonda foi sintetizada e os dois lotes foram comparados pelo segundo operador no instrumento Realplex usando reagentes LuminoCt^® (reagentes diferentes dos originalmente testados) (Figura 11.23). Ambas as sondas produziram dados de amplificação, sendo que a nova sonda pareceu um pouco melhor do que a original, embora seja importante observar que a sonda original foi enviada entre laboratórios de teste e, portanto, estava em temperatura ambiente, em solução, por vários dias. Nesse estágio, ficou claro que tanto o ensaio original quanto o de substituição funcionaram quando executados pelo segundo operador com reagentes LuminoCt^® no instrumento Realplex.

Portanto, os motivos restantes para a falha original foram considerados:

• Operador: o experimento foi repetido várias vezes por um cientista experiente e, portanto, essa foi considerada uma explicação improvável.
  
• Instrumento: poderia ter alguns problemas, pois alguns outros ensaios estavam falhando.
  
• Reagentes: explicação mais fácil de testar. Os reagentes LuminoCt^® foram comparados com os reagentes existentes usando ambos os lotes de oligonucleotídeo no instrumento ABi StepOne, pelo primeiro operador. A reação falhou com os reagentes originais, mas apresentou boa amplificação com os reagentes LuminoCt^® (Figura 11.24).

Figura 11.21. Os primers para EIFB1 foram testados em concentrações entre 200 nM e 900 nM. Não foi observada amplificação em nenhuma condição (oligonucleotídeos e reagentes ABi no ABi StepOne Plus).

Figura 11.22. Dois lotes de primers para EIFB1 foram comparados no reagente SYBR Green I; o lote original com falha e um novo lote. (oligonucleotídeos e reagentes no instrumento Eppendorf Realplex). Ambos os conjuntos de primers suportaram a amplificação.

Figura 11.23. Dois lotes de primers e sondas para EIFB1 foram comparados no reagente LuminoCt®; o lote original com falha e um novo lote. (oligonucleotídeos e reagentes no instrumento Eppendorf Realplex). Ambos os conjuntos de oligonucleotídeos suportaram a amplificação.

Figura 11.24. O ensaio do primer e da sonda EIFB1 foi executado em dois reagentes diferentes (reagente Original ABi ou LuminoCt®). Os dados só foram adquiridos desse ensaio quando executados com os reagentes LuminoCt®.

A eficiência da reação foi incorreta e variável

Um teste foi realizado em uma diluição em série de um oligonucleotídeo artificial, usando um primer padrão e um ensaio de sonda. O ensaio havia sido originalmente desenvolvido e otimizado em um instrumento diferente, mas o efeito de diluição estranho não era esperado quando transferido para um laboratório e instrumento de teste diferentes (Figura 11.25A). Todas as condições do ensaio foram otimizadas novamente para serem específicas do novo laboratório, mas sem alteração dos dados. O operador observou que o efeito era mais pronunciado quando o ensaio era repetido em poucas horas, usando a mesma série de diluição. Como parte do processo de resolução de problemas, o ensaio foi executado em um instrumento diferente por um operador diferente que, novamente, gerou a curva padrão esperada. Isso levou à sugestão de que o problema inicial era devido a erro do operador, falha do instrumento ou alguma variação sutil no procedimento experimental. Como os dois operadores são altamente experientes e o instrumento estava funcionando bem em outros experimentos, a opção de diferenças sutis foi examinada. Uma pista importante foi a observação da variabilidade nos dados da mesma série de diluição após um período de armazenamento das amostras a 4 °C (Figuras 11.25A e 11.25B). Isso levou a um exame dos tubos usados para a série de diluição e a um teste de alternativas. Depois de mudar para tubos de reação Eppendorf de 1,5 ml para a série de diluição, a curva padrão prevista foi gerada (Figura 11.25C), demonstrando que é essencial que a biologia molecular, os materiais plásticos de baixa retenção sejam selecionados para PCR e que esses ensaios são sensíveis a variações sutis no protocolo.

Figura 11.25A. Um modelo de oligonucleotídeo artificial foi diluído 10 vezes e detectado usando um ensaio específico baseado em sonda. Há diferenças inconsistentes entre os gráficos de amplificação.

Figura 11.25B. Um modelo de oligonucleotídeo artificial foi diluído 10 vezes (essas são as diluições detectadas na Figura 11.25A) e deixado a 4 °C por várias horas antes de ser detectado usando um ensaio específico baseado em sonda. Há diferenças inconsistentes entre os gráficos de amplificação, que são exacerbadas pelo tempo entre a diluição e o teste.

Figura 11.25C. Um modelo de oligonucleotídeo artificial foi diluído 10 vezes em tubos de grau e detectado usando um ensaio específico baseado em sonda. Há diferenças consistentes entre os gráficos de amplificação, como esperado.

Resumo - Lista de verificação de resolução de problemas de PCR

• Verifique a qualidade da amostra (material degradado causará resultados errôneos).
  
• Verifique se o protocolo de RT é compatível com o design (por exemplo, um RT com primer Oligo-dT deve ter um ensaio de qPCR no 3' 1 kb da sequência).
  
• Verifique o modelo do ensaio.
  
• Verifique todos os controles.
  
• Verifique os primers usando corante SYBR green I/execute um gel.
  
• Verifique se as configurações do software estão corretas (linha de base, detecção de corante, concentrações para padrões).
  
• Certifique-se de que a concentração de ROX seja aplicável ao instrumento (e não interfira com o multiplex).
  
• Verifique os níveis de fluorescência de fundo.
  
• Verifique a marcação da sonda com o ensaio de DNase I ou repita a síntese da sonda.